Naidheachdan

Tapadh leibh airson tadhal air Nature.com.Chan eil ach beagan taic CSS aig an tionndadh brobhsair a tha thu a’ cleachdadh.Airson an eòlas as fheàrr, tha sinn a’ moladh gun cleachd thu brobhsair ùraichte (no cuir à comas Modh Co-chòrdalachd ann an Internet Explorer).Anns an eadar-ama, gus dèanamh cinnteach à taic leantainneach, bheir sinn seachad an làrach gun stoidhlichean agus JavaScript.
Tha ceallan aillse air grunn dhòighean a leasachadh gus faighinn thairis air cuideam cealla agus cumail a’ dol air adhart.Is e Protein kinase R (PKR) agus an gnìomhaiche pròtain (PACT) a’ chiad luchd-freagairt a bhios a’ cumail sùil air diofar chomharran cuideam a tha a’ leantainn gu casg air iomadachadh cealla agus apoptosis.Ach, tha riaghladh slighe PACT-PKR ann an ceallan aillse fhathast gu ìre mhòr neo-aithnichte.An seo, lorg sinn gu bheil RNA fada neo-chòdachadh (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) gu dìreach an sàs ann a bhith a’ casg slighe PACT-PKR agus a’ brosnachadh iomadachadh cealla aillse.A’ cleachdadh sgrìonadh gnìomh mòr de lncRNA co-cheangailte ri aillse CRISPRi 971, lorg sinn gu robh DARS-AS1 co-cheangailte ri iomadachadh cealla aillse a bha gu mòr nas fheàrr.Mar sin, tha bualadh DARS-AS1 a’ cur bacadh air iomadachadh cealla agus a’ brosnachadh apoptosis cealla aillse ann an grunn loidhnichean cealla aillse in vitro agus a’ lughdachadh gu mòr fàs tumhair ann am vivo.Gu meacanaigeach, bidh DARS-AS1 a ’ceangal gu dìreach ris an raon gnìomhachaidh PACT agus a’ casg eadar-obrachadh PACT-PKR, mar sin a ’lughdachadh gnìomhachd PKR, eIF2α phosphorylation, agus a’ cur casg air bàs cealla apoptotic.Gu clionaigeach, tha DARS-AS1 air a chuir an cèill gu farsaing ann an ioma aillsean, agus tha cus cuideam air an lncRNA seo mar chomharra air droch prognosis.Tha an sgrùdadh seo a’ soilleireachadh riaghladh sònraichte aillse air an t-slighe PACT-PKR le DARS-AS1 lncRNA agus a’ toirt seachad targaid eile airson prognosis agus làimhseachadh aillse.
Tha an comas atharrachadh gu cuideam na fheart cudromach de bhith beò agus iomadachadh cealla aillse.An iomadachadh luath agus comharran metabollach de stùc aillse ann am meanbh-àrainneachdan cruaidh - bochdainn beathachaidh, hypoxia, agus pH ìosal - a dh’ fhaodadh slighean comharran bàs cealla a bhrosnachadh.Thathas gu tric a’ faicinn dì-riaghladh de ghinean a tha mothachail air cuideam leithid p535, pròtanan clisgeadh teas 6, 7, KRAS8, 9, agus HIF-110, 11, 12, 13 ann an aillse, mar sin a’ bacadh apoptosis agus a’ brosnachadh mairsinn.
Tha Protein kinase R (PKR) na neach-mothachaidh cuideam cudromach agus fo-aonad kinase de fhactar tòiseachaidh eukaryotic 2α (eIF2α), riaghlaiche eadar-theangachaidh a tha a’ ceangal cuideam cealla ri bàs cealla.Chaidh PKR a chomharrachadh an toiseach mar phròtain anti-bhìorasach le bhith a’ lorg RNA dà-shreath cèin (dsRNA).Nuair a thèid a ghnìomhachadh, bidh PKR phosphorylates eIF2α gus casg a chuir air synthesis pròtain viral agus ceallach14,15,16.Chaidh PACT (pròtain activator PKR) a chomharrachadh mar a’ chiad phròtain gnìomhaiche PKR às aonais dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Tro eadar-obrachadh dìreach le PKR, bidh PACT a’ gluasad diofar cuideaman (acras serum, peroxide no làimhseachadh arsenite) gu PKR agus slighean comharran sìos an abhainn.A bharrachd air fosphorylation eIF2α, bidh gnìomhachd PKR le meadhan PACT a’ piobrachadh grunn thachartasan co-cheangailte ris an fhreagairt cuideam, a’ toirt a-steach inbhe redox atharraichte tro shlighe PI3K / Akt24, sgrùdadh milleadh DNA leasaichte tro p5325,26 agus NF-κB27,28 A’ riaghladh tar-sgrìobhadh, 29. Leis an àite riatanach aca ann am freagairt cuideam, iomadachadh, apoptosis agus prìomh phròiseasan cealla eile, tha PKR agus PACT a’ gealltainn targaidean teirpeach airson mòran ghalaran, gu sònraichte aillse30,31,32,33.Ach, a dh’ aindeoin a’ chudrom gnìomh agus bith-eòlasach pleiotropic seo, tha riaghladh gnìomhachd PACT/PKR ann an ceallan aillse fhathast do-ruigsinneach.
Tha lncRNAn nan tar-sgrìobhaidhean nas motha na nucleotides 200 gun chomas còdadh pròtain.Leis gu bheil pròiseactan seicheamhan genoma iomlan air na mìltean de lncRNAn a chomharrachadh, chaidh mòran oidhirp a dhèanamh gus na gnìomhan bith-eòlasach aca a shoilleireachadh.Tha buidheann rannsachaidh a tha a’ sìor fhàs air sealltainn gu bheil lncRNAn an sàs ann am mòran phròiseasan bith-eòlasach37 a’ toirt a-steach riaghladh neo-ghnìomhachd X-chromosome38,39, clò-bhualadh40, tar-sgrìobhadh41,42, eadar-theangachadh43 agus eadhon fàs aillse44,45,46,47.Thuirt na sgrùdaidhean sin gu bheil mòran lncRNAn an sàs anns an t-slighe PACT / PKR.Sheall aon sgrùdadh mar seo gun do chuir lncRNA ASPACT bacadh air tar-sgrìobhadh PACT agus barrachd gleidheadh ​​​​niùclasach de PACT mRNA.Tha sgrùdaidhean eile air sealltainn gu bheil lncRNA nc886 a’ ceangal ri PKR agus a’ cur bacadh air a fosphorylation49,50.Gu ruige seo, cha deach aithris a thoirt air lncRNA a tha a’ riaghladh gnìomhachd PKR le meadhan PACT.
Tha aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) air a chomharrachadh mar lncRNA51,52,53,54 oncogenic.Tro riaghladh miP-194-5p53, miP-12952 agus miP-532-3p51, thathas air sealltainn gu bheil DARS-AS1 a’ brosnachadh fàs carcinoma cealla dubhaig soilleir, carcinoma thyroid agus carcinoma sgamhain cealla neo-bheag, fa leth.Lorg Tong agus co-obraichean cuideachd gu bheil DARS-AS1 a’ brosnachadh adhartas myeloma le bhith a’ cumail suas seasmhachd motif pròtain 39 (RBM39) ceangailte ri RNA.Ach, cha deach sgrùdadh sam bith a dhèanamh a thaobh a bheil an lncRNA seo an sàs ann an riaghladh gnìomhachd PACT-PKR agus freagairt cuideam ceallan aillse.
An seo, rinn sinn scrion call-gnìomh air sgèile mhòr a’ cleachdadh siostam CRISPRi agus cho-dhùin sinn gu bheil DARS-AS1 lncRNA a’ brosnachadh iomadachadh grunn sheòrsaichean de cheallan aillse.A bharrachd air an sin, tha sinn air inneal mòr a chomharrachadh: tha DARS-AS1 a’ ceangal gu dìreach ri PACT, a’ bacadh ceangal PACT agus PKR, a’ cur casg air fosphorylation de eIF2α, substrate PKR nas ìsle, agus aig a’ cheann thall a’ bacadh bàs cealla apoptotic.Gu crìch, tha ar n-obair a’ nochdadh an lncRNA DARS-AS1 mar riaghlaiche air an t-slighe PACT-PKR agus targaid a dh’fhaodadh a bhith ann airson làimhseachadh aillse agus prognosis.
Tha sgrùdaidhean pròifil genomic farsaing air ceudan de lncRNAn a chomharrachadh co-cheangailte ri aillse.Ach, tha an gnìomh aca fhathast gu ìre mhòr neo-aithnichte56.Gus tagraichean lncRNA gealltanach a chomharrachadh a tha an sàs ann an adhartas aillse, rinn sinn scrion call-gnìomh airson iomadachadh nas lugha ann an loidhne cealla aillse colorectal SW620 a’ cleachdadh siostam CRISPRi (Fig. 1a).Is e am feart sònraichte de loidhnichean cealla aillse coloin SW480 agus SW620 gu bheil iad a’ tighinn bho tumors bun-sgoile agus àrd-sgoile ann an aon euslainteach.Tha seo a’ toirt seachad coimeas luachmhor airson a bhith a’ sgrùdadh atharrachaidhean ginteil ann an adhartas aillse coloin adhartach.Mar sin, rinn sinn mion-sgrùdadh air tar-sgrìobhaidhean loidhnichean cealla aillse colorectal (SW480 agus SW620) a’ cleachdadh seicheamh RNA agus chruinnich sinn cuid de lncRNAn gnìomh a dh’ fhaodadh a bhith bhon litreachas foillsichte.Stèidhichte air na co-dhùnaidhean sin, dhealbhaich sinn leabharlann sgRNA còmhla anns an robh 7355 sgRNA oligos ag amas air 971 lncRNAs co-cheangailte ri aillse agus 500 oligos sgRNA gun amas airson smachd àicheil (Dàta Leasachail 1).
Riochdachadh sgeamaigeach de sgrìonadh a’ cleachdadh siostam CRISPRi.b saidhbhreas sgRNA an dèidh sgrìonaidh.Tha an loidhne dhotagach chòmhnard a’ riochdachadh log2 (atharrachadh fillte) = ±0.58.Tha an loidhne dhotagach dhìreach a’ comharrachadh luach p = 0.05.Tha dotagan dubha a’ riochdachadh sgRNA neo-targaid (ainmichte mar NC).Tha dotagan dearga nan sgRNAn a tha ag amas air DARS-AS1.Tha dotagan gorma nan sgRNAn a tha ag amas air LINC00205, lncRNA oncogenic a chaidh a mhìneachadh roimhe seo.atharrachadh fillte = (leughadh àbhaisteach, latha 17) / (leughadh àbhaisteach, latha 0).c Chuir leagail sgRNA DARS-AS1 bacadh air fàs cealla.Tha bàraichean mearachd a’ riochdachadh ± claonadh àbhaisteach nan trì deuchainnean.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 dà-earball deuchainn t Oileanach.d abairt DARS-AS1 ann am tumors (stòr-dàta TCGA).em Cur an cèill DARS-AS1 ann an sampallan àbhaisteach agus tumhair càraid bho euslaintich le BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, agus COAD, fa leth (stòr-dàta TCGA).chaidh p-luachan fhaighinn a’ cleachdadh deuchainn-t Oileanach dà-earball càraideach.
Às deidh dhuinn am plasmid a thogail agus an lentivirus a phacadh, chuir sinn thairis loidhne cealla aillse colorectal dCas9-SW620 leis an leabharlann gu h-àrd ann an ceithir deuchainnean gabhaltachd neo-eisimeileach.B’ e iomadachd gabhaltachd (MOI) airson na galairean sin 0.1-0.3, a’ nochdadh nach urrainnear gach cealla a ghluasad ach le aon sgRNA.Às deidh 18 latha de chultar in vitro, lughdaich no mheudaich ìomhaigh beairteachaidh sgRNAn targaid às deidh sgrìonadh, fhad ‘s a dh’ fhan an àireamh de oligonucleotides smachd neo-chuimsichte an ìre mhath gun atharrachadh an taca ris a ’phròifil ro-sgrìonaidh, a’ nochdadh gu bheil raon sònraichte sònraichte aig an targaid againn. leabharlann.Reis.1b agus clàr a bharrachd 1). Chaidh LINC00205, a chaidh aithris roimhe gus aillse sgamhain adhartachadh agus adhartas aillse grùthan58,59,60, a sgrìobadh a-mach (log2 (foldchange) < −0.58, p luach < 0.05), a’ dearbhadh earbsachd an sgrìonaidh seo (Fig. 1b). Chaidh LINC00205, a chaidh aithris roimhe gus aillse sgamhain adhartachadh agus adhartas aillse grùthan58,59,60, a sgrìobadh a-mach (log2 (foldchange) < −0.58, p luach < 0.05), a’ dearbhadh earbsachd an sgrìonaidh seo (Fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). Chaidh LINC00205, a chaidh aithris roimhe gus adhartas aillse sgamhain adhartachadh agus aillse grùthan58,59,60, a chuir a-mach (log2 (atharrachadh fillte) <-0.58, p-luach <0.05), a’ dearbhadh cho làidir sa tha an sgrìonadh seo (Fig. .1b) . Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 肺癌 和 和 肝癌 肝癌 肝癌 肝癌 进展 筛 筛 选 该 该 该 可靠性 (的 1b). Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 肺癌 和 和 肝癌 肝癌 肝癌 肝癌 进展 筛 筛 选 该 该 该 可靠性 (的 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). Chaidh LINC00205, a chaidh aithris roimhe gus adhartas aillse sgamhain agus ae a bhrosnachadh58,59,60, a chuir a-mach (log2 (atharrachadh fillte) <-0.58, p-luach <0.05), a’ dearbhadh cho làidir sa tha an sgrìonadh seo (Fig. .1b).
Am measg a h-uile lncRNAn a chaidh a dhearbhadh, chaidh DARS-AS1 a sgrìobadh cuideachd, leis na trì oligonucleotides sgRNA cognatach air an lughdachadh gu mòr às deidh 18 latha de chultar, a’ moladh gun tug leagail an lncRNA seo lùghdachadh air iomadachadh aillse (Fig. 1b).Fhuair an toradh seo tuilleadh taic bho sgrùdadh MTS ann an ceallan aillse colorectal a ’sealltainn nach deach ìre fàis ceallan leagail DARS-AS1 a ghearradh ach ann an leth an coimeas ri ceallan smachd (Figear 1c) agus bha e co-chòrdail ri aithisgean roimhe de ghrunn sheòrsan aillse eile.: aillse dubhaig cealla soilleir, aillse thyroid agus aillse sgamhain neo-bheag51,52,53,55.Ach, tha a ghnìomh agus na dòighean moileciuil ann an aillse colorectal fhathast gun sgrùdadh.Mar sin, thagh sinn an lncRNA seo airson tuilleadh sgrùdaidh.
Gus sgrùdadh a dhèanamh air abairt DARS-AS1 ann an euslaintich, rinn sinn mion-sgrùdadh coileanta air 10,327 sampall tumhair bhon phròiseact Cancer Genome Atlas (TCGA).Tha na co-dhùnaidhean againn a’ sealltainn gu bheil DARS-AS1 air a chuir an cèill gu farsaing agus air a riaghladh gu mòr ann an ceallan fallain ann an grunn tumhair, a’ toirt a-steach adenocarcinoma coloin (COAD), carcinoma cealla soilleir dubhaig (KIRC), agus carcinoma cealla papillary dubhaig (KIRP)..Glè bheag (Fig. 1d agus Fig. Leasachail 1a, b). Dhaingnich mion-sgrùdadh air sampallan fallain / tumhair paidhir tuilleadh abairt gu math nas àirde de DARS-AS1 ann am tumors carcinoma urothelial bladder (BLCA), carcinoma cealla soilleir dubhaig (KIRC), adenocarcinoma prostate (PRAD), carcinoma cealla squamous sgamhain (LUSC) , carcinoma endometrial corpus uterine (UCEC), adenocarcinoma sgamhain (LUAD), carcinoma hepatocellular ae (LIHC), carcinoma cealla papillary dubhaig dubhaig (KIRP), agus adenocarcinoma coloin (COAD) (luach p <0.05) (Fig. 1e–m) . Dhaingnich mion-sgrùdadh air sampallan fallain / tumhair paidhir tuilleadh abairt gu math nas àirde de DARS-AS1 ann am tumors carcinoma urothelial bladder (BLCA), carcinoma cealla soilleir dubhaig (KIRC), adenocarcinoma prostate (PRAD), carcinoma cealla squamous sgamhain (LUSC) , carcinoma endometrial corpus uterine (UCEC), adenocarcinoma sgamhain (LUAD), carcinoma hepatocellular ae (LIHC), carcinoma cealla papillary dubhaig dubhaig (KIRP), agus adenocarcinoma coloin (COAD) (luach p <0.05) (Fig. 1e–m) .Dhearbh mion-sgrùdadh air sampallan fallain / tumhair càraideach cuideachd gu bheil DARS-AS1 gu math nas àirde ann an carcinoma urothelial bladder (BLCA), carcinoma cealla dubhaig agus dubhaig soilleir (KIRC), adenocarcinoma prostate (PRAD), tumors carcinoma cealla squamous sgamhain (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m). , carcinoma endometrial den corpus uteri (UCEC), adenocarcinoma na sgamhain (LUAD), carcinoma hepatocellular an ae (LIHC), carcinoma cealla papillary an dubhaig (KIRP), agus adenocarcinoma a’ choloin (COAD) (luach p < 0.05) (Fig. 1e– m) .配对 健康 / 肿瘤样本 的 分析 进 进 了 了 1 1 在 尿路 尿路 尿路 尿路 尿路 透明 透明 透明 透明 透明 透明 (lusc) 肿瘤 中 的显着 更 高 表达, 子宫体子宫 内膜 癌 (UCEC), 肺腺癌 (Luad), 肝肝 细胞癌 (Kirp) 和结肠腺癌 (Cad) (P 值<0.05）（图1e-m） .配 对 健康 / 肿瘤样本 的 分析 证实 证实 上 上 上 上 皮癌 皮癌 皮癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌腺腺癌 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 更 高 高 表达 表达 (Ucel) 肝肝 细胞癌 (lihc) 肾 肾 乳头状癌 (kirp) (coad) (p 值 <0.05) (图1e-m） .Thug mion-sgrùdadh air sampallan fallain / tumhair le paidhir taic a bharrachd do àite DARS-AS1 ann an carcinoma urothelial bladder (BLCA), carcinoma cealla dubhaig soilleir (KIRC), adenocarcinoma prostate (PRAD), agus tumors carcinoma cealla squamous sgamhain (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). abairt ann an carcinoma corpus uterine (UCEC), adenocarcinoma sgamhain (LUAD), carcinoma hepatocellular (LIHC), carcinoma cealla papillary dubhaig (KIRP), agus adenocarcinoma coloin (COAD) (luach p <0.05) (Figear 1e -m).Air an gabhail còmhla, tha na toraidhean sin a’ nochdadh gu bheil DARS-AS1 air a chuir an cèill gu farsaing agus gu mòr ann an grunn aillsean.
Leis gu bheil DARS-AS1 agus DARS (an gine a tha a’ còdachadh an dualan antisense) a’ roinn an aon neach-adhartachaidh agus gu bheil iad suidhichte ri taobh a chèile, dhealbhaich sinn shRNA gus DARS-AS1 a leagail gu sònraichte ach chan e DARS (Fig. 2a Leasachail, b agus Clàr Leasachail 2) .A bharrachd air SW620, chleachd sinn cuideachd trì loidhnichean cealla eile a’ cur an cèill DARS-AS1 gu mòr gus sgrùdadh a dhèanamh air èifeachd agus gnìomh leagail shRNA (Clàr Leasachail 3).Chomharraich na co-dhùnaidhean againn gun do choilean na trì shRNAn a chaidh a leasachadh co-dhiù 80% èifeachdas leagail DARS-AS1 le glè bheag de bhuaidh air an ìre de DARS mRNA (Fig. 2c-f a bharrachd).A bharrachd air an sin, lorg sinn gun do chuir leagail DARS-AS1 leis na shRNAn sin bacadh mòr air fàs cealla ann an loidhnichean cealla aillse colorectal SW620 (49.7%) agus HCT116 (27.7%), loidhne cealla aillse broilleach MBA-MD-231 (53.4%).) agus loidhne cealla hepatoma HepG2 (lùghdachadh 92.7%), a bharrachd air an comas raointean gun acair a chruthachadh (lùghdachadh cuibheasach de ~50.8%, 44.6%, 40.7% agus 75.7% gach loidhne cealla) (Fig. 2a,b).Ann an SW620, dhearbh toraidhean an assay cruthachadh coloinidh cuideachd gun do chuir DARS-AS1 shRNA bacadh mòr air iomadachadh cealla le lùghdachadh cuibheasach de mu 69.6% (Fig. 2c).
Buaidh smachd shRNA agus DARS-AS1 shRNA air iomadachadh cealla (a) agus cruthachadh spheroid (b) ann an ceallan SW620, HCT116, MBA-MD-231, agus HepG2.c Buaidh smachd shRNA agus DARS-AS1 shRNA air cruthachadh coloinidh ann an ceallan SW620.Iomadachadh cealla (d), cruthachadh spheroid (e), agus cruthachadh coloinidh (f) de cheallan SW620 a’ toirt cus cuideam air DARS-AS1.Is e an dàta a tha air a shealltainn an ciall ± claonadh àbhaisteach de thrì deuchainnean.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, agus *** p ≤ 0.001 le dà-earball deuchainn t Oileanach.
Gus cur ri sgrùdaidhean call-gnìomh, chruthaich sinn an uairsin ceallan SW620 a’ toirt cus cuideam air DARS-AS1 (Fig. 2g a bharrachd).Mheudaich overexpression DARS-AS1 gu mòr fàs cealla (1.8-fold), cruthachadh spheroid gun acair (1.4-fold), agus cruthachadh coloinidh (3.3-fhillte) ann an ceallan SW620 (Fig. 2d-f).Dhaingnich sinn an toradh seo le bhith a’ cleachdadh loidhne cealla cuir an cèill DARS-AS1, A549.Chaidh an leudachadh cealla leasaichte seo mar thoradh air overexpression DARS-AS1 fhaicinn tuilleadh ann an ceallan A549 (Fig. 2h a bharrachd, i agus Clàr Leasachail 3).Air an gabhail còmhla, tha na sgrùdaidhean buannachd is call seo a’ sealltainn gu bheil DARS-AS1 a’ brosnachadh iomadachadh cealla aillse in vitro.
Gus sgrùdadh a dhèanamh air an uidheamachd bhunaiteach leis am bi DARS-AS1 a’ riaghladh iomadachadh cealla, rinn sinn mion-sgrùdadh tarraing sìos RNA gus na com-pàirtichean a dh’ fhaodadh a bhith ceangailte ri pròtain a chomharrachadh.Sheall toraidhean RT-qPCR gu bheil timcheall air 86.2% de DARS-AS1 suidhichte ann an cytoplasm de cheallan SW620 (Fig. 3a a bharrachd).Chaidh an DARS-AS1 no pseudoRNA biotinylated ath-sgrìobhaidh in vitro an uairsin a bhrosnachadh le lysates cealla SW620 agus an uairsin dealachadh SDS-PAGE.Sheall staining airgid às deidh sin gun robh còmhlan sònraichte (~38 kDa) air a bheairteachadh gu mòr ann an sampallan tarraing DARS-AS1 ach chan ann ann an sampallan RNA no grìogagan meallta (Fig. 3a).Chaidh an còmhlan seo a chomharrachadh mar phròtain gnìomhachaidh PKR (PACT) le mòr-speactrometry (MS) agus air a dhearbhadh tuilleadh le immunoblotting ann an loidhnichean cealla SW620, HCT116, agus HepG2 (Fig. 3a,b).Chaidh beairteas DARS agus pròtanan PACT co-cheangailte riutha - PKR agus TRBP - a sgrùdadh cuideachd a’ cleachdadh mion-sgrùdadh RNA le Western blotting (WB).Sheall na toraidhean nach deach eadar-obrachadh dìreach eadar DARS-AS1 RNA agus na trì pròtanan sin a lorg (Fig. 3b a bharrachd).Chaidh an eadar-obrachadh sònraichte eadar DARS-AS1 agus PACT a dhearbhadh tuilleadh le mion-sgrùdadh RNA immunoprecipitation (RIP), a sheall gu robh DARS-AS1 air a bheairteachadh gu mòr ann an antibodies an-aghaidh PACT ach chan e RNAan smachd eile (Figear 3c).Gus faighinn a-mach a bheil DARS-AS1 ag eadar-obrachadh gu dìreach le PACT às aonais co-phàirtean ceallach sam bith eile, chaidh assay in vitro biolayer interferometry (BLI) a dhèanamh a’ cleachdadh PACT fìor-ghlan.Chaidh DARS-AS1 le bileag biotin no RNA meallta a ghluasad air biosensors streptavidin (SA) agus an uairsin a thoirt a-steach ann am bufair cinneachail anns an robh 1 μM PACT.Gu sònraichte, bha PACT ceangailte gu làidir ri DARS-AS1 (luach KD ~ 26.9 nM), ach gun a bhith ag atharrais air RNA (Figear 3d).Air an gabhail còmhla, tha na toraidhean sin a’ nochdadh eadar-obrachadh dìreach agus dàimh àrd eadar DARS-AS1 agus PACT.
Chomharraich mion-sgrùdadh tarraing RNA DARS-AS1 ag eadar-obrachadh le PACT ann an ceallan SW620.Gu h-àrd, staining airgid de phròtainean co-cheangailte.Chaidh immunoblots nas ìsle a dhèanamh le antibody an-aghaidh PACT.b Chaidh mion-sgrùdadh tarraing-sìos RNA a dhèanamh ann an ceallan HCT116 (mullach) agus HepG2 (bonn).Chaidh beairteas PACT a lorg le immunoblotting.Chaidh measaidhean immunoprecipitation cRNA (RIP) a dhèanamh ann an ceallan SW620 a’ cleachdadh na antibodies comharraichte.d Chaidh lùban ceangail PACT gu DARS-AS1 làn-fhaid no RNA smachd fhaighinn a’ cleachdadh biolayer interferometry (BLI).Chaidh RNA a ghluasad air biosensor streptavidin.Chaidh 1 μM PACT a chleachdadh gus co-cheangal a thomhas.e chaidh measadh tarraing RNA a dhèanamh a’ cleachdadh DARS-AS1 làn-fhad biotinylated no truncated (mullach).Immunoblot a’ sealltainn PACT a fhuaireadh (bonn).f Chaidh PACT le bratach fìor-ghlan a thoirt a-steach le DARS-AS1 làn-fhad biotinylated no a ghearradh sìos (mar ann an e) airson measadh RIP in vitro.Chaidh an RNA a chaidh a thoirt a-mach a dhearbhadh le RT-qPCR.g Chaidh an dàimh eadar diofar phìosan RNA airson PACT fhaighinn le bhith a’ cleachdadh biolayer interferometry.Airson mion-sgrùdadh, chaidh 100 nM RNA agus 1 μM RAST a chleachdadh.h Chaidh measaidhean RIP in vitro a dhèanamh a’ cleachdadh PACT làn-ghlan no truncated le bileag.Chaidh an RNA a chaidh a thoirt a-mach a dhearbhadh le RT-qPCR.i Ìre fàis de cheallan SW620 a’ toirt cus cuideam air DARS-AS1, PACT, no an dà chuid.j Bha buaidh eadar-dhealaichte aig cus cuideam air DARS-AS1 làn-fhaid no truncated ann an ceallan SW620 air fàs cealla.k Chaidh apoptosis a lorg le immunoblotting le antibody anti-PARP.l Bidh Knockout of DARS-AS1 a’ toirt a-steach apoptosis de cheallan SW620 mar a chithear le sruthadh cytometry.Is e an dàta a tha air a shealltainn an ciall ± claonadh àbhaisteach de thrì deuchainnean. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, **** p < 0.0001, le deuchainn oileanach dà-earbaill. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, **** p < 0.0001, le deuchainn oileanach dà-earbaill. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, **** p < 0.0001 le deuchainn-t Oileanach dà-earball. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, 通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, 通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, **** p < 0.0001 le deuchainn-t Oileanach dà-earball.
An uairsin chruthaich sinn trì pìosan RNA DARS-AS1 biotinylated le tar-sgrìobhadh in vitro gus an roinn DARS-AS1 a tha riatanach airson ceangal PACT (Figear 3e) a chomharrachadh.Sheall toraidhean mion-sgrùdadh RNA gun robh gach criomag comasach air eadar-obrachadh le PACT, ach sheall an roinn 3 ′-terminal (384-768 nucleotides le bileag A3) barrachd air 1-384 nucleotides le bileag A1) (Fig. 3e).Chaidh toraidhean co-chosmhail fhaicinn anns an assay RIP in vitro a’ cleachdadh PACT ath-chuingealaichte (Figear 3f).Co-chòrdail ris na co-dhùnaidhean sin, sheall deuchainnean gus pìosan RNA neo-ghluasadach a cheangal ri PACT a’ cleachdadh BLI cuideachd gu bheil dàimh nas àirde aig PACT airson A3 (384-768 nt) (luach KD timcheall air 94.6 nM), ged nach eil ceangal sam bith aige ri raointean eile.(Fig. 3d).
Rinn sinn sgrùdadh cuideachd air na roinnean ceangail co-cheangailte ann am PACT.Tha trì raointean gnìomh ann am PACT, agus tha dhà dhiubh sin nan raointean ceangail RNA dà-shreath (dsRBD) agus an treas raon (ainmichte D3) a bhios ag obair mar ghnìomhaiche eadar-obrachaidhean pròtain.Gus sgrùdadh a dhèanamh air comas ceangail lncRNA gach raon, innleachadh sinn trì mùthaidhean a thug air falbh gach aon de na trì raointean agus a rinn measadh RIP in vitro.Sheall na co-dhùnaidhean againn gun do lughdaich sguabadh às an treas raon (D3) de PACT gu mòr an eadar-obrachadh le DARS-AS1 (le 0.11-fold an taca ri PACT iomlan) an coimeas ris an dà mhùthadh eile (Fig. 3h), chaidh a shealltainn gun robh an sgaoileadh de D3 ag eadar-obrachadh le DARS.-AC1.Air an gabhail còmhla, tha na toraidhean sin a’ moladh gum faodadh eadar-obrachadh eadar DARS-AS1 agus PACT tachairt sa mhòr-chuid tro dheireadh 3 ′ de DARS-AS1 agus an raon D3 de PACT.
Thug sinn fa-near nach robh buaidh sam bith aig DARS-AS1 air abairt PACT agus cha robh buaidh sam bith aig PACT air DARS-AS1 (Fig. 3c Leasachail).Rinn sinn sgrùdadh an uairsin air buaidh leagail PACT air fàs cealla.An coimeas ri DARS-AS1, dh'fhàs ceallan càirdeach 1.5-3 tursan nas luaithe nuair a chaidh PACT a leagail (Fig. 3d a bharrachd).Sheall toraidhean an sgrùdaidh cruthachadh coloinidh gun do chruthaich na ceallan coloinidhean 2-3-fhillte às deidh làimhseachadh shRNA le PACT (Fig. 3e a bharrachd).Gus dearbhadh a bheil DARS-AS1 a’ riaghladh iomadachadh cealla tro PACT, chruthaich sinn ceallan SW620 a’ toirt cus cuideam air PACT, DARS-AS1, no an dà chuid.Sheall overexpression de PACT casg mòr air iomadachadh cealla (Figear 3i).Fhad ‘s a bha cus cuideam DARS-AS1 per se gu mòr a’ brosnachadh iomadachadh cealla, cha robh eadar-dhealachadh mòr ann an ìre fàis cheallan a bha a ’toirt cus cuideam air DARS-AS1 agus PACT.Tha na co-dhùnaidhean sin a’ moladh gum faodadh PACT cuir an-aghaidh an àrdachadh ann an iomadachadh air adhbhrachadh le cus cuideam DARS-AS1.
Leis gu bheil comasan ceangail PACT eadar-dhealaichte aig diofar roinnean de DARS-AS1, rinn sinn sgrùdadh air a’ bhuaidh càirdeach aca air iomadachadh cealla le bhith a’ toirt thairis air diofar mhìrean DARS-AS1.An coimeas ris an dà chriomag eile, bha DARS-AS1 air a dhol thairis air aig deireadh 3 ′ (384-768 nt), am prìomh roinn co-cheangailte ri PACT ann an DARS-AS1, aig an robh an comas as àirde airson iomadachadh cealla a bhrosnachadh (Fig. 3j).Tha na toraidhean sin a’ nochdadh co-dhàimh adhartach eadar comas ceangail agus gnìomh bith-eòlasach DARS-AS1.
Thathas ag aithris gu bheil PACT na phròtain pro-apoptotic19.Mar sin, rinn sinn sgrùdadh air buaidh DARS-AS1 air apoptosis.Mar a bhiodh dùil, mheudaich leagail DARS-AS1 gu mòr cleavage PARP ann an ceallan SW620 agus mheudaich e a’ chuibhreann de cheallan V-positive annexin ann an loidhnichean cealla SW620, HCT116, HepG2, agus MBA-MD-231 (Fig. 3k).3).3f – h), a’ nochdadh gu bheil buaidh anti-apoptotic DARS-AS1 ann an ceallan aillse mu choinneamh gnìomh brosnachaidh apoptosis aig PACT.Air an gabhail còmhla, tha na co-dhùnaidhean sin a’ moladh gum faodadh an dòigh airson gnìomh oncogenic DARS-AS1 a bhith tro bhacadh air gnìomh PACT.
An uairsin, rinn sinn sgrùdadh air na buaidhean gnìomh a tha aig comann DARS-AS1-PACT.Thathas air aithris gu bheil PACT a’ cur an gnìomh PKR tro eadar-obrachadh dìreach, a leasaicheas fosphorylation eIF2α, ag adhbhrachadh cuir às eadar-theangachadh agus apoptosis17.An toiseach, rinn sinn sgrùdadh a bheil DARS-AS1 a’ toirt buaidh air sgìreachadh cealla PACT agus PKR.Sheall microscopy fluorescence confocal gu robh PACT agus PKR air an co-shuidheachadh gu mòr ann an ceallan SW620 le co-èifeachd co-dhàimh cuibheasach Pearson de 0.72.Aig an aon àm, lughdaich cus cuideam DARS-AS1 gu mòr co-shuidheachadh PACT agus PKR (co-èifeachd co-dhàimh Pearson 0.61) (Figear 4a).Gus sgrùdadh a dhèanamh an gabhadh DARS-AS1 an eadar-obrachadh PACT-PKR atharrachadh, rinn sinn assay co-immunoprecipitation (co-IP) le antibody anti-PACT ann an lysates cealla SW620.Bha PKR air a bheairteachadh gu mòr ann an anti-PACT ann an ceallan smachd, fhad ‘s a bha ath-bheothachadh PKR air a lughdachadh gu mòr ann an lysates bho cheallan a’ toirt cus cuideam air DARS-AS1 (Fig. 4b).Chaidh PACT agus PKR le bileagan puraichte a chleachdadh airson measaidhean ceangail pròtain in vitro.A rèir sin, sheall an fheadhainn a thug seachad DARS-AS1 ach gun smachd RNA eadar-obrachadh PACT-PKR a chaidh a chumail fodha (Figear 4c).Sheall a h-uile toradh gun do chuir DARS-AS1 dragh air conaltradh PACT agus PKR.
chaidh co-shuidheachadh PACT agus PKR ann an ceallan smachd no ceallan a bha a’ toirt cus cuideam air DARS-AS1 a choimhead a’ cleachdadh microscopy fluorescence confocal.Bha na niùclasan air an dath le DAPI.Chaidh toraidhean staitistigeil fhaighinn bho 16 dealbhan.b Co-immunoprecipitation (co-IP) a’ cleachdadh antibody an-aghaidh PACT ann an lysates cealla smachd SW620 ceallan no ceallan a’ toirt cus cuideam air DARS-AS1.c Chaidh PACT le bileagan, PKR air a ghlanadh agus ath-sgrìobhadh in vitro le DARS-AS1 no meallta RNA a bhrosnachadh airson mion-sgrùdadh ceangail pròtain in vitro.Chaidh antibodies anti-bratach a chleachdadh airson immunoprecipitation.d Chaidh immunoblots leis na antibodies comharraichte a dhèanamh ann an ceallan SW620 agus HCT116 air an gluasad le smachd shRNA no DARS-AS1-shRNA agus an uairsin leis an acras serum.Dh’ atharraich ìrean abairt DARS-AS1 cugallachd cealla gu thapsigargin.Chaidh ceallan SW620 a ghluasad le DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 overexpression plasmid no smachd plasmid.Bhathar a’ làimhseachadh cheallan le thapsigargin airson 48 uair a thìde agus chaidh comas obrachaidh cealla a dhearbhadh a’ cleachdadh an reactant MTS.f Chaidh DARS-AS1 ath-sgrìobhaidh in vitro no RNA dummy agus PACT fìor-ghlan a chleachdadh airson assay gnìomhachaidh in vitro agus lorg immunoblot.g Chaidh immunoblots a’ cleachdadh na antibodies sin a dhèanamh air ceallan SW620-ctrl (clì) no ceallan a’ toirt cus cuideam air mutants PKR (deas).Chaidh na ceallan sin an uairsin a ghluasad le smachd shRNA no DARS-AS1-shRNA agus an uairsin leis an acras serum.h Sheall cytometry sruthadh gun robh neo-ghnìomhachd an mutant PKR a’ dèanamh dìoladh airson apoptosis air a bhrosnachadh le DARS-AS1 ann an ceallan SW620.i Chaidh immunoblots leis na antibodies comharraichte a dhèanamh ann an ceallan SW620 (clì) no HCT116 (deas).Tha ceallan air an tar-chuir le shRNA smachd no DARS-AS1 shRNA ann an easbhaidh serum agus air an cur ris le inhibitor 100 nM PKR C16 no DMSO.Bàr sgèile = 5 µm.Is e an dàta a tha air a shealltainn an ciall ± claonadh àbhaisteach de thrì deuchainnean.* p ≤ 0.05 dà-earball deuchainn t Oileanach.
Thathas den bheachd sa chumantas, aon uair ‘s gu bheil PACT ag eadar-obrachadh le PKR17, gum faodar fosphorylation PKR aig Thr451 a thoirt a-steach.Sheall na co-dhùnaidhean againn gun deach an ìre de phosphorylation PKR àrdachadh gu mòr ann an ceallan leagail DARS-AS1 às deidh acras serum (Fig. 4d agus Fig. 4a Leasachail).Mar sin, lorg sinn gun robh fosphorylation de eIF2α, prìomh substrate PKR, cuideachd air àrdachadh gu mòr le DARS-AS1 shRNA (Fig. 4d agus Leasachail Fig. 4a).Tha Thapsigargin na chuideam ER a bheir air an ER Ca2+ a leigeil ma sgaoil.Thathas air aithris gu bheil làimhseachadh le thapsigargin a’ toirt a-steach faireachdainn agus gnìomhachadh PACT, a bhios ag eadar-obrachadh le agus a’ gnìomhachadh PKR, a’ leantainn gu apoptosis le bhith a’ meudachadh fosphorylation eIF2α 18,61.An seo, chleachd sinn thapsigargin mar inneal brosnachaidh air an t-slighe PACT / PKR gus sgrùdadh a dhèanamh an urrainn dha DARS-AS1 ceallan a chuideachadh gus faighinn thairis air cuideam le bhith a’ cur bacadh air slighe PACT / PKR.Chunnaic sinn gu robh an ìre de abairt DARS-AS1 ceangailte gu dearbhach ri strì cealla ri thapsigargin.Mhair ceallan SW620 le cus cuideam air DARS-AS1 nas fheàrr nuair a chaidh an làimhseachadh le thapsigargin, fhad ‘s a dh’ fhàs ceallan le leagail DARS-AS1 nas buailtiche (Fig. 4e).Co-chòrdail ris na toraidhean sin, lughdaich cus cuideam DARS-AS1 fosphorylation PKR air a bhrosnachadh le thapsigargin (Fig. 4b).An coimeas ri sin, às deidh làimhseachadh thapsigargin, chaidh PKR agus eIF2α a phosphorylated gu ìre nas àirde ann an ceallan leagail DARS-AS1 an coimeas ri ceallan smachd (Fig. 4b a bharrachd).Gu h-inntinneach, dh’adhbhraich thapsigargin abairt DARS-AS1 ann an dòigh a bha an urra ri dòs, a dh’ fhaodadh a bhith a’ nochdadh gnìomh an-aghaidh cuideam DARS-AS1 (Fig. 4c a bharrachd).A bharrachd air an sin, rinn sinn measaidhean gnìomhachd in vitro gus na beachdan sin a dhearbhadh.Ann an ùine ghoirid, chaidh PKR a ghlanadh bho lysates cealla le bhith a’ cleachdadh antibody an-aghaidh PKR, an uairsin air a ghintinn le PACT ath-chuimseach agus DARS-AS1 air ath-sgrìobhadh in vitro.Às deidh an ath-bhualadh enzymatic, chaidh phospho-PKR a lorg a’ cleachdadh WB.Sheall na co-dhùnaidhean againn gun deach bacadh mòr a chuir air fosphorylation PKR le DARS-AS1, ach chan ann le smachd RNA (Figear 4f).Tha na toraidhean in vitro agus in vivo seo a’ moladh gu bheil DARS-AS1 a’ cur bacadh air gnìomhachd PKR le meadhan PACT.Aig an aon àm, chunnaic sinn cuideachd lùghdachadh ann an ath-bheothachadh PACT an làthair DARS-AS1 (Figear 4f).Tha an toradh seo co-chòrdail ri toraidhean a’ mheasaidh ceangail pròtain in vitro (Figear 4c) agus a-rithist a’ nochdadh gnìomh bacaidh DARS-AS1 airson ceangal PACT-PKR.
Tha feum air Ser246 agus Ser287 ann an raon D3 de PACT airson gnìomhachd PKR fo chuideam cealla.Le bhith a’ cur an àite dà fhuigheall serine airson alanine thug mutant PACT (mutD), a chuir an gnìomh PKR às aonais cuideam, agus ionadachadh airson alanine (mutA) am protocol air ais.Leis gu bheil sinn air sealltainn cho cudromach sa tha an raon seo ann an co-cheangal dìreach ri DARS-AS1, chruthaich sinn an dà mutants PACT seo gus dearbhadh am faodadh na fuigheall sin a bhith an sàs ann an eadar-obrachadh le DARS-AS1 cuideachd.Gu inntinneach, chaill an dà mutants an comas ceangal a dhèanamh ri DARS-AS1 (Fig. 4d Leasachail), a’ moladh gur dòcha gu bheil feum air structar iomlan a’ phròtain PACT airson eadar-obrachadh èifeachdach le DARS-AS1.
A bharrachd air an sin, tha na co-dhùnaidhean againn cuideachd a’ moladh gum faodar casg air iomadachadh cealla a tha air adhbhrachadh le DARS-AS1-shRNA ath-nuadhachadh gu ìre le bhith a ’toirt cus cuideam air mutant PACT àicheil (PACTmutA) no mutant PKR àicheil ceannasach (PKRmut) (Fig. 4e. a bharrachd).Lùghdaich cus cuideam de mutants PKR ceannasach-àicheil fosphorylation PKR air adhbhrachadh le leagail DARS-AS1 a bharrachd air fosphorylation eIF2α ann an ceallan le dìth serum (Fig. 4g).Nas cudromaiche, chaidh a’ chuibhreann de cheallan apoptotic air an adhbhrachadh le leagail DARS-AS1 a lughdachadh cuideachd ann an ceallan a bha a ’toirt cus cuideam air PKRmut (Fig. 4h agus Fig. 4g a bharrachd).Tha casg air gnìomhachd PKR kinase cuideachd a’ toirt buaidh air gnìomh DARS-AS1, oir sheall toraidhean gur ann ainneamh a bhrosnaich leagail DARS-AS1 fosphorylation PKR agus eIF2α nuair a chaidh ceallan a làimhseachadh le neach-dìon C16 sònraichte PKR (Fig. 4i agus Fig. 4h a bharrachd).).Air an gabhail còmhla, tha na toraidhean againn a’ moladh gu bheil DARS-AS1 a’ brosnachadh iomadachadh cealla, gu ìre co-dhiù, le bhith a’ cur bacadh air gnìomhachd PKR le meadhan PACT.
Gus tuilleadh sgrùdaidh a dhèanamh air àite DARS-AS1 ann am tumorigenesis, rinn sinn ann an deuchainnean vivo a’ cleachdadh modal xenograft luch. Tha toraidhean a’ sealltainn gun do lughdaich leagail DARS-AS1 fàs tumhair ann an luchagan gu mòr (luach p <0.0001) (Fig. 5a). Tha toraidhean a’ sealltainn gun do lughdaich leagail DARS-AS1 fàs tumhair ann an luchagan gu mòr (luach p <0.0001) (Fig. 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p.5, 0). Tha na toraidhean a’ sealltainn gu bheil leagail DARS-AS1 gu mòr a’ lughdachadh fàs tumhair ann an luchagan (luach p <0.0001) (Figear 5a).结果表明, DARS-AS1 的敲 低 显 着 降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）结果表明, DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长 (p 值<0.0001) (图5a） 。 Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значен) <5,0. Sheall na toraidhean gun do lughdaich leagail DARS-AS1 gu mòr fàs tumhair ann an luchagan (luach p <0.0001) (Figear 5a).Mar sin, anns a’ bhuidheann leagail DARS-AS1, bha lùghdachadh mòr ann an tomhas tumhair cuibheasach timcheall air 72.9% agus meud tumhair cuibheasach timcheall air 87.8% (Figear 5b-d).Tha na co-dhùnaidhean sin a’ moladh gu làidir gum faod DARS-AS1 àrdachadh mòr a thoirt air fàs tumhair ann am vivo.
Buaidhean leagail ad DARS-AS1 air oncogenesis colorectal ann an luchagan nude.Tha lùban fàis (a), meud tumhair (b), cuideam (c), agus ìomhaighean tumhair (d).Tha bàraichean mearachd a’ riochdachadh ± SEM. n = 10. ****p < 0.0001, le deuchainn oileanach dà-earbaill. n = 10. ****p < 0.0001, le deuchainn oileanach dà-earbaill. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0.0001 Deuchainn t Oileanach dà-earball.n = 10. ****p <0.0001, 通过双尾学生t 检验. ****p <0.0001, 通过双尾学生t检验. ****p <0,0001 an-asgaidh airson a' chriosdaidh a' cleachdadh. ****p <0.0001 deuchainn-t oileanach dà-earball.e Rinn Kaplan-Meier mion-sgrùdadh air a’ cho-dhàimh eadar ìrean faireachdainn DARS-AS1 agus mairsinneachd iomlan ann an euslaintich le UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, agus LGG.Bha ìrean àrda de abairt DARS-AS1 ann an euslaintich anns an 50% as àirde;bha an ìre ìosal de abairt DARS-AS1 ann an euslaintich anns an 50% as ìsle.chaidh luachan-p a dhearbhadh a’ cleachdadh an deuchainn ìre log.f Modail a thathar a’ moladh anns am bi DARS-AS1 a’ riaghladh slighe PACT-PKR agus fàs tumhair.
Gus tuigse nas fheàrr fhaighinn air buaidh clionaigeach DARS-AS1, rinn sinn sgrùdadh air a’ cho-cheangal eadar a bhith a’ faireachdainn agus a bhith beò le euslaintich.Le bhith a’ dèanamh anailis air seata-dàta TCGA, lorg sinn gu robh abairt DARS-AS1 nas àirde co-cheangailte ri melanoma uveal (UVM), cromophobia dubhaig (KICH), carcinoma cealla papillary dubhach (KIRP), mesothelioma (MESO), ioma-fhillte.Bha mairsinn nas ìsle ceangailte gu mòr ri glioblastoma morphosis (GBM) agus euslaintich le glioma eanchainn aig ìre ìosal (LGG) (Figear 5e).Tha na toraidhean sin a’ moladh gum faodadh àite cudromach a bhith aig DARS-AS1 ann an adhartas tumhair clionaigeach agus gum faodadh iad a bhith na bhith-chomharran ro-innseach ann an ioma aillsean.
Anns an sgrùdadh seo, a’ cleachdadh sgrìonadh gnìomh CRISPRi air sgèile mhòr, cho-dhùin sinn gu bheil DARS-AS1 lncRNA a’ faighinn thairis air cuideam cealla aillse le bhith a’ riaghladh dà phrìomh neach-freagairt cuideam, PACT agus PKR.Le bhith ag eadar-obrachadh gu dìreach le PACT, chuir DARS-AS1 bacadh air gnìomhachd PKR le meadhan PACT, mar sin a’ cur casg air bàs cealla apoptotic agus a’ brosnachadh iomadachadh cealla (Fig. 5f).Thathas air a bhith a’ cumail sùil air ath-riaghladh DARS-AS1 ann an grunn sheòrsaichean aillse, a’ moladh gum faodadh a ghnìomh ann a bhith a’ brosnachadh mairsinneachd cealla aillse fo chumhachan cuideam a bhith iomchaidh san fharsaingeachd do dh’ iomadh seòrsa aillse.
Chaidh PACT a chomharrachadh mar phròtain gnìomhaiche PKR, agus tha gnìomhachd PKR le meadhan PACT a’ cluich pàirt chudromach ann am freagairtean cuideam le bhith a’ riaghladh tar-sgrìobhadh, eadar-theangachadh, apoptosis, agus pròiseasan cealla cudromach eile62.Airson deicheadan, chaidh oidhirpean a dhèanamh gus riaghladh aillse sònraichte air cascade PACT-PKR a thuigsinn.An seo, nochd an sgrùdadh againn dòigh eadar-dhealaichte airson riaghladh PACT-PKR ann an ceallan aillse tro lncRNA ceallach DARS-AS1, a tha a’ ceangal gu dìreach ri PACT, a’ bacadh eadar-obrachadh PACT-PKR, a’ bacadh gnìomhachd PKR agus fosphorylation eIF2α, mar sin a’ cur bacadh air apoptosis air adhbhrachadh le cuideam agus a’ brosnachadh iomadachadh aillse mu dheireadh.ceallan.Tha an lorg seo a’ toirt solas air targaidean lncRNA a dh’fhaodadh a bhith ann airson prognosis agus leigheas aillse.
Sheall an dàta againn gu bheil leagail DARS-AS1 a’ mothachadh cheallan gu acras serum le àrdachadh mòr ann am PKR fosphorylated agus eIF2α.Tha na co-dhùnaidhean sin a’ moladh gu bheil DARS-AS1 a’ brosnachadh mairsinn cealla aillse fo chumhachan cruaidh le bhith a’ cur bacadh air gnìomhachd PACT/PKR.Tha grunn RNAn neo-còdaidh eile, leithid ASPACT agus nc886, cuideachd an sàs anns an axis PACT/PKR le bhith a’ dì-riaghladh PACT48 mRNA no a’ riaghladh autophosphorylation le bhith a’ ceangal ri PKR49,50,64.Nam measg, tha DARS-AS1 ag obair mar aimhreit air a’ chomann PACT-PKR.Tha an sgrùdadh seo a’ neartachadh ar tuigse air riaghladh axis PACT/PKR agus àite lncRNAn ann am freagairtean cuideam.
Tha trì raointean eadar-dhealaichte ann am PACT.Tha gach aon den chiad dà dsRBD gu leòr gus ceangal àrd-dàimh PACT ri PKR a choileanadh, agus tha feum air an treas raon (D3) airson gnìomhachd PKR in vitro agus in vivo.Sheall an sgrùdadh againn gu bheil DARS-AS1 ag eadar-obrachadh leis an raon D3 (Fig. 3h).Leis cho mòr sa tha an lncRNA (768 nucleotides), faodaidh ceangal DARS-AS1 ri D3 bacadh corporra a chuir air an eadar-obrachadh eadar raon PACT de dsRBD agus PKR, agus mar sin a’ bacadh ceangal PACT agus PKR.Chuir mùthaidhean puing PACT a chuir alanine no aspartate an àite Ser246 agus Ser287 ann an D3 dragh air a’ cheangal ceangailteach ri DARS-AS1, a’ nochdadh cho cudromach sa bha feartan structarail is dealain iomlan D3 nan ceangal.Bidh feum air tuilleadh fiosrachaidh mun uidheamachd seo san àm ri teachd, a’ cleachdadh mion-sgrùdadh bith-cheimiceach nas mionaidiche agus mion-sgrùdadh structarail PACT àrd-rèiteachaidh.
Tha sgrùdaidhean roimhe air aithris gu bheil DARS-AS1 a’ brosnachadh iomadachadh cealla tro ghrunn dhòighean 51,52,53.Ann an aon eisimpleir, chunnaic luchd-sgrùdaidh gun do rinn DARS-AS1 suas a ghine DARS còdachadh pròtain antisensense le bhith ag amas air miP-194-5p ann an ceallan aillse dubhaig.Ach, anns an sgrùdadh làithreach, cha robh mòran buaidh aig leagail DARS-AS1 air tar-sgrìobhadh DARS ann an grunn sheòrsaichean aillse, a’ toirt a-steach co-dhiù cansearan colorectal, broilleach agus ae.Leis gu bheil lncRNAn a’ taisbeanadh pàtrain faireachdainn a tha sònraichte do cheallan is clò, is dòcha nach tèid dòighean gnìomh a ghleidheadh ​​​​thairis air seòrsachan aillse, a dh’ fhaodadh cur ris an eadar-dhealachadh seo eadar ar beachdan agus measaidhean roimhe air diofar aillsean.Tha feum air sgrùdaidhean sònraichte gus dòighean sònraichte diofar phròiseasan eòlas-inntinn agus pathology a shoilleireachadh.
Sheall mion-sgrùdadh air dàta clionaigeach gu bheil ceangal eadar-mhalairteach aig abairt DARS-AS1 ann am tumors ri mairsinn euslaintich aillse, a tha a’ daingneachadh cho cudromach sa tha an axis DARS-AS1 / PACT / PKR ann an prognosis aillse.Gu co-dhùnadh, tha an sgrùdadh againn a’ sealltainn gu bheil DARS-AS1 na riaghlaiche air an axis chomharran PACT/PKR, a’ brosnachadh iomadachadh cealla aillse, agus a’ cur bacadh air apoptosis rè freagairt cuideam, a bheir seachad loidhne rannsachaidh eile agus a tha inntinneach airson rannsachadh san àm ri teachd air leigheasan a dh’fhaodadh a bhith ann. .
Chaidh loidhnichean cealla daonna SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 agus HEK293T fhaighinn bhon Bhun-structar Goireas Loidhne Cell Nàiseanta ann an Sìona.Chaidh a h-uile cealla a chumail ann am meadhan DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) le taic bho 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) agus 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) aig 37 ° C, 5% CO2.goireadair.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764) );anti-eIF2α (phosphorus S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosfair S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulin, CST (2128);luchag àbhaisteach IgG, CST (5415S);coineanach àbhaisteach IgG, CST (2729S).Chaidh antibodies a lagachadh 1:1000 ann am PBST airson blotadh an Iar agus 1:100 airson IP.
Chaidh sgRNAn a leasachadh a’ cleachdadh inneal a tha ri fhaighinn gu poblach ris an canar CRISPR-ERA66.Chleachd sinn na paramadairean inneal bunaiteach airson leasachadh sgRNA agus dh’ obraich an algairim làraich ceangail sgRNA anns an roinn 3 kb.stèidhichte air TSS.Chaidh amaran de oligonucleotides sgRNA a cho-chur ann an CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) agus an clonadh a-steach do plasmids pgRNA daonna (Addgene #44248).Chaidh 12 µg gu h-iomlan de plasmid pgRNA daonnaichte cruinnichte, 7.2 µg de psPAX2 (Addgene #12260), agus 4.8 µg de pMD2.G (Addgene #12259) a cho-ghluasad gu 5 x 106 HEK293T ann an soithichean 1fecta ceallan (CWBIO, Beijing, Sìona) a’ leantainn stiùireadh an neach-dèanamh.Chaidh supernatants anns an robh bhìoras a chruinneachadh 48 agus 72 uair às deidh an tar-chuir agus an sìoladh tro shìoltachan 0.45 µm.Airson sgrìonadh, chaidh ceallan SW620 a chuir an cèill am pròtain fusion dCas9 / KRAB fhaighinn le tar-chuir bhìoras.Chaidh ceallan SW620 atharraichte a ghlacadh leis an leabharlann bhìoras ann an ceithir deuchainnean gabhaltachd neo-eisimeileach aig MOI de 0.1-0.3 agus chaidh an samplachadh le 2 μg / ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) airson 2 latha.Às deidh sin, bha ceallan air an àiteachadh airson 18 latha in vitro le còmhdach leabharlainn as ìsle de 500 cealla / sgRNA airson sgrìonadh.
Chaidh DNA genomic a thoirt a-mach a rèir stiùireadh an QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, A’ Ghearmailt; 51183).Gu h-iomlan, chaidh 100 μg de DNA genomic gach ath-aithris bith-eòlasach a chleachdadh gus an leabharlann a thogail.Chaidh an roinn sgRNA a mheudachadh le dà chuairt de PCR agus a cheangal ri còd-bàr.
Chaidh toraidhean PCR a ghlanadh le bhith a’ cleachdadh inneal glanaidh NucleoSpin® gel agus PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, a’ Ghearmailt; 740609.250) agus air an tomhas le bhith a’ cleachdadh pasgan lorg DNA dà-shreath Qubit ™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Chaidh an assay MTS a chleachdadh gus iomadachadh cealla a thomhas.Chaidh ceallan a shìolachadh ann am pleitean 96-tobar aig dùmhlachd tùsail de 2000 cealla / tobar.Chaidh an àireamh coimeasach de cheallan a thomhas gach latha aig an àm ainmichte airson 4-6 latha gu h-iomlan.Airson gach tobar, chaidh 20 μl de reagent MTS (Promega) a lagachadh le 100 μl de DMEM, air a ghiùlan le ceallan airson 4 h aig 37 ° C, agus an uairsin chaidh OD490 a thomhas.
Chaidh an comas airson fàs gun acair a lorg le bhith a’ dèanamh anailis air cruthachadh raointean.Gu h-aithghearr, bha ceallan 2000 air an gluasad le shRNA DARS-AS1 no smachd shRNA air an àiteachadh ann am microplates ceangail ultra ìosal (Corning) le atharrachadh meadhanach gach 4 latha.Chaidh na spheroids a chunntadh às deidh 14 latha.Chaidh ceallan 500 a chaidh an gluasad leis an DARS-AS1 overexpression plasmid no plasmid smachd a chleachdadh airson an assay adhartachaidh, air neo cha robh an dòigh air atharrachadh.
Chaidh RNA ath-sgrìobhadh le bhith a’ cleachdadh T7 RNA polymerase agus biotin-16-UTP (Roche 1138908910) a rèir stiùireadh Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Tha na primers a thathar a’ cleachdadh an seo air an liostadh ann an Clàr Leasachail 4.
Chaidh roinnean còdaidh pròtain PACT no PKR a ghleusadh gu pET15b (Addgene #73619) agus an cruth-atharrachadh gu BL21 (DE3).Chaidh na bacteria a bhrosnachadh thar oidhche ann an LB le ampicillin air a sholarachadh agus an uairsin air a lagachadh 100-fhillte le LB ùr.Nuair a ràinig an OD600 den mheadhan 0.8, chaidh 1 mM IPTG a chuir ris gus faireachdainn pròtain a bhrosnachadh.Às deidh goir thar oidhche le crathadh socair (250 rpm aig 20 ° C), chaidh am pellet cealla a chruinneachadh le centrifugation (4000 rpm, 10 min, 4 ° C).Ath-chuir am peilear cealla ann am bufair lysis (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) agus goir air deigh airson 30 min, an uairsin sonicate (15 min, 5 s air / dheth, air deigh) agus centrifuge (13,000 rpm)., 30 mionaid, 4 ° C).Chaidh an supernatant an uairsin a luchdachadh air roisinn Ni-NTA (QIAGEN) 3 tursan aig 4 ° C, air a nighe 4 tursan le bufair nighe (50 mM Tris, pH 8.0, imidazole 40 mM, 250 mM NaCl) agus air a lughdachadh 3 tursan, le àireamh iomlan de bufair eluent 10 ml (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, imidazole 300 mM).Chaidh pròtain puraichte a dhearbhadh le bhith a’ cleachdadh WB agus chaidh an dùmhlachd a dhearbhadh le bhith a’ cleachdadh pasgan measaidh pròtain Qubit ™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Chaidh measaidhean RIP a dhèanamh mar a chaidh a mhìneachadh roimhe, le atharrachaidhean.Gu h-aithghearr, bufair 1x RIP (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) lyses cytostatic 1 x 107 cocktail (Roche, 1 mM DTT) agus centrifuge aig 13,000 rpm airson 15 min aig 4 ° C.Chaidh an supernatant an uairsin a thoirt a-steach le grìogagan magnetach pròtain A + G (Millipore) còmhla ri 5 μg de antibody anti-PACT (Abeam) no IgG (CST).Chaidh na grìogagan a nighe 5 tursan le bufair 5x RIP, an uairsin air an cnàmhadh le proteinase K (NEB).Chaidh RNA a thoirt a-mach le Trizol agus a dhearbhadh le RT-qPCR.Tha prìomhairean air an taisbeanadh ann an Clàr Leasachail 5.
Chaidh am measadh RIP in vitro a dhèanamh a rèir protocol àbhaisteach atharraichte RIP assay.Chaidh 5 pmol gu h-iomlan de RNA ath-sgrìobhaidh in vitro a lagachadh 1x le bufair RIP agus a chuir an sàs le goir aig 65 ° C airson 5 mionaidean agus an uairsin fuarachadh slaodach gu teòthachd an t-seòmair.Chaidh 5 pmol gu h-iomlan de phròtainean PACT le bileag bratach slàn no mutated a ghlanadh bho E. coli.Goir le RNA ath-nuadhaichte airson 2 uair aig 4 ° C agus lean am modh gu h-àrd airson mion-sgrùdadh RIP airson IP an-aghaidh bratach.
Airson mion-sgrùdadh leudachaidh RNA, chaidh ceallan 1 × 107 a chòmhdach le bufair 1xRIP.Às deidh centrifugation aig 13,000 rpm airson 15 min aig 4 ° C, chaidh an supernatant a làimhseachadh le 30 μl de ghrìogagan magnetach streptavidin (Beckman) airson 2 h aig 4 ° C.Chaidh an lysate fìor-ghlan an uairsin a thoirt seachad le tRNA beirm agus a thoirt a-steach le 40 pmol de RNA ath-nuadhaichte thar oidhche aig 4 ° C, an uairsin airson 2 uair eile agus chaidh 20 μl de ghrìogagan magnetach streptavidin ùra air am bacadh le BSA a chuir ris.Bha an ceum nighe air a dhèanamh suas de 4 tursan le bufair 5x RIP agus 4 tursan le bufair 1x RIP.Chaidh na pròtanan co-fhreagarrach a chuir a-mach le bufair biotin elution (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) agus air an sgaradh air NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Às deidh staining airgid (Beyotime Biotechnology), chaidh cuid de chòmhlain a chuir às agus a sgrùdadh le MS.
Chaidh mion-sgrùdadh Co-IP a dhèanamh gus deuchainn a dhèanamh air an eadar-obrachadh eadar PACT agus PKR.Ann an ùine ghoirid, chaidh lysates supernatant ullachadh le bhith a’ toirt a-steach ceallan lysed 1 x 107 ann am bufair 1 x RIP agus an uairsin centrifugation aig 13,000 rpm airson 15 mionaidean aig 4 ° C.Bha lysates air an luchdachadh le grìogagan magnetach pròtain A + G, air an co-luachadh le 5 µg de antibody anti-PACT, agus air an cuairteachadh gu socair thar oidhche aig 4 ° C.Chaidh na grìogagan a nighe 3 tursan le bufair 5 × RIP, dà uair le bufair 1 × RIP agus air am fàgail le bufair 1 × SDS.Chaidh am pròtain a chaidh fhaighinn air ais a sgrùdadh le gel SDS-PAGE agus a lorg le WB.
Chaidh dà pmol de PACT le bratach agus 1 pmol de PKR a ghlanadh bho E. coli.Caolaich ann am bufair 1 × RIP agus goir le 10 pmol de RNA ath-nuadhaichte airson 2 uair aig 4 ° C.Às deidh sin, chaidh an toirt a-steach le antibody anti-labeled magnet-conjugated pròtain A + G airson dà uair a bharrachd.Chaidh na grìogagan an uairsin a nighe ceithir tursan le bufair 1x RIP agus an cuir a-mach le bufair 1x SDS.Chaidh am PACT agus PKR a thàinig às a sin a lorg le WB.