Naidheachdan

Tapadh leibh airson tadhal air Nature.com.Chan eil ach beagan taic CSS aig an tionndadh brobhsair a tha thu a’ cleachdadh.Airson an eòlas as fheàrr, tha sinn a’ moladh gun cleachd thu brobhsair ùraichte (no cuir à comas Modh Co-chòrdalachd ann an Internet Explorer).Anns an eadar-ama, gus dèanamh cinnteach à taic leantainneach, bheir sinn seachad an làrach gun stoidhlichean agus JavaScript.
Thathas a’ cleachdadh dhòighean labeling faisg air enzymatic stèidhichte air eistirean gnìomhaichte no radicals phenoxy gu farsaing gus proteomes subcellular agus eadar-theachdaichean pròtain ann an ceallan beò a mhapadh.Ach, chan eil eistirean gnìomhaichte cho reactive, a’ leantainn gu radius labeling farsaing, agus faodaidh radicals phenoxy a thig bho làimhseachadh peroxide bacadh a chuir air slighean redox.An seo tha sinn ag aithris air dòigh photoactivation an urra ri bileagan faisg air làimh (PDPL) a chaidh a leasachadh le bhith a’ ceangal gu ginteil am pròtain photosensitizer miniSOG ri pròtain inntinneach.Air a bhrosnachadh le solas gorm agus air a smachdachadh le ùine nochdaidh, thèid ocsaidean singlet a chruthachadh agus an uairsin thèid bileagan fuigheall histidine fhuasgladh gu spatiotemporally leis an probe aniline.Bidh sinn a’ taisbeanadh a dhìlseachd àrd tro mhapadh proteome a tha sònraichte do organelle.Tha coimeas taobh ri taobh de PDPL le TurboID a’ sealltainn còmhdach proteomic nas mionaidiche agus nas coileanta de PDPL.An uairsin, chuir sinn PDPL an sàs anns a’ cho-ghnìomhaiche tar-sgrìobhaidh BRD4 agus E3 Parkin ligase co-cheangailte ri galair agus lorg sinn eadar-theachdaichean nach robh aithnichte roimhe.Le sgrìonadh overexpression, chaidh dà fho-strat neo-aithnichte, Ssu72 agus SNW1, a chomharrachadh airson Parkin, aig a bheil ìsleachadh air a mheadhanachadh leis an t-slighe ubiquitination-proteasome.
Tha comharrachadh ceart de lìonraidhean pròtain mar bhunait air mòran phròiseasan cealla bunaiteach.Mar sin, bheir mapadh spatiotemporal fìor cheart de eadar-obrachaidhean pròtain bunait moileciuil airson a bhith a’ mìneachadh slighean bith-eòlasach, pathology galair, agus a’ cur dragh air na h-eadar-obrachaidhean sin airson adhbharan teirpeach.Gus seo a dhèanamh, tha dòighean a tha comasach air eadar-obrachadh ùineail a lorg ann an ceallan beò no maothran gu math ion-mhiannaichte.Thathas gu h-eachdraidheil air a bhith a’ cleachdadh Mass Spectrometry Purification Affinity (AP-MS) gus com-pàirtichean ceangailteach de phròtainean inntinneach (POI) a chomharrachadh.Le leasachadh modhan proteomics cainneachdail, chaidh Bioplex3.0 a chruthachadh, an stòr-dàta as motha de lìonraidhean pròtain stèidhichte air AP-MS.Ged a tha AP-MS gu math cumhachdach, tha na ceumannan lysis cealla agus caolachaidh anns an t-sruth-obrach ag amas air eadar-obrachaidhean ceangail lag agus neo-ghluasadach agus a’ toirt a-steach stuthan post-lysis leithid paidhrichean eadar-obrachaidh spùtach aig nach eil roinn ro lysis.
Gus dèiligeadh ris na cùisean sin, chaidh amino-aigéid mì-nàdarrach (UAA) le buidhnean tar-cheangail agus àrd-ùrlaran labeling enzymatic faisg air làimh (PL) (me APEX agus BioID)5 a leasachadh.Ged a chaidh an dòigh UAA a chuir an sàs gu soirbheachail ann an iomadh suidheachadh agus a bheir seachad fiosrachadh mu ghreamaichean pròtain dìreach, tha feum fhathast air làrach cuir a-steach UAA a mheudachadh.Nas cudromaiche, is e dòigh labeling stoichiometric a th’ ann aig nach eil tionndadh catalytach de thachartasan bileagan.An coimeas ri sin, bidh modhan enzymatic PL, leithid an dòigh BioID, a’ ceangal an biotin ligase einnseanaichte gu POI7, a bhios an uairsin a’ gnìomhachadh biotin gus ester biotinyl-AMP reactive a chruthachadh.Mar sin bidh an enzyme a’ catalachadh agus a’ leigeil a-mach “sgòth biotin” gnìomhaichte a bhios a’ comharrachadh fuigheall lysine faisg air làimh.Ach, feumaidh BioID barrachd air 12 uairean gus comharra leubail gu leòr fhaighinn, a chuireas casg air a chleachdadh le rùn ùineail.A’ cleachdadh mean-fhàs stiùirichte stèidhichte air taisbeanadh beirm, chaidh TurboID a dhealbhadh stèidhichte air BioID gus a bhith nas èifeachdaiche, a’ ceadachadh bileagan èifeachdach le biotin taobh a-staigh 10 mionaidean, a’ leigeil le pròiseasan nas beothaile a bhith air an sgrùdadh.Leis gu bheil TurboID gu math gnìomhach agus gu bheil ìrean biotin endogenous gu leòr airson bileagan aig ìre ìosal, bidh bileagan cùl-fhiosrachaidh na dhuilgheadas nuair a bhios feum air bileagan àrd-leasaichte agus ùineail le bhith a’ cur biotin exogenous ris.A bharrachd air an sin, tha eistirean gnìomhaichte gu math reactive (t1 / 2 ~ 5 min), a dh’ fhaodadh radius mòr labeling adhbhrachadh, gu h-àraidh às deidh sùghadh pròtainean faisg air làimh le biotin 5. Tha APEX air a chleachdadh gu farsaing gus proteomes subcellular, iom-fhilltean pròtain membran, agus iom-fhilltean pròtain comharran cytosolic11,12 a chomharrachadh. pròiseasan cealla.
Mar sin, bidh dòigh ùr a tha comasach air gnèithean casg radius le bileagan nas reactive a ghineadh le fìor chruinneas farsaingeachd agus ùineail gun a bhith a’ cur dragh mòr air slighean ceallach na chur-ris cudromach ris na dòighean a th’ ann mar-thà. Am measg nan gnèithean reactive, thog ocsaidean singlet ar n-aire mar thoradh air a bheatha ghoirid agus an radius sgaoilidh cuibhrichte (t1/2 <0.6 µs ann an ceallan)13. Am measg nan gnèithean reactive, thog ocsaidean singlet ar n-aire mar thoradh air a bheatha ghoirid agus an radius sgaoilidh cuibhrichte (t1/2 <0.6 µs ann an ceallan)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Am measg nan cruthan gnìomhach, tharraing singlet ocsaidean ar n-aire air sgàth a bheatha ghoirid agus an radius sgaoilidh cuibhrichte (t1/2 <0.6 µs ann an ceallan)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6茕漉 1/2 < 0.6 µs) 13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Am measg chruthan gnìomhach, bidh ocsaidean singlet a’ tarraing ar n-aire air sgàth a bheatha ghoirid agus an radius sgaoilidh cuibhrichte (t1/2 <0.6 μs ann an ceallan).Thathas ag aithris gu bheil Singlet ocsaidean a’ oxidachadh methionine, tyrosine, histidine agus tryptophan air thuaiream, ga fhàgail polar 14,15 airson a cheangal ri probes stèidhichte air amine no thiol16,17.Ged a chaidh ocsaidean singlet a chleachdadh gus RNA roinn subcellular a chomharrachadh, tha ro-innleachdan airson comharran faisg air POI endogenous ath-chleachdadh fhathast gun sgrùdadh.An seo, bidh sinn a’ taisbeanadh àrd-ùrlar ris an canar bileagan faisg air làimh a tha an urra ri photoactivation (PDPL), far am bi sinn a’ cleachdadh solas gorm gus POIs a shoilleireachadh air a cheangal le photosensitizer miniSOG agus gineadh ocsaidean singlet a bhrosnachadh gus fuigheall faisg air làimh a oxidachadh, agus an uairsin atharrachaidhean anns a bheil amine gus probes ceimigeach a oxidachadh a-steach. ceallan beò eadar-mheadhanach..Rinn sinn deuchainn air buidheann de sgrùdairean ceimigeach gus sònrachas tagaichean a mheudachadh agus làraich atharrachaidh a chomharrachadh a’ cleachdadh sruth-obrach proteomics fosgailte.Tha coimeas taobh ri taobh de PDPL le TurboID a’ sealltainn còmhdach proteomic nas mionaidiche agus nas coileanta de PDPL.Chuir sinn an dòigh-obrach seo an sàs ann an comharran sònraichte organelle den proteome subcellular agus comharrachadh proteome coitcheann de chom-pàirtichean ceangail airson pròtain riaghlaidh epigenetic co-cheangailte ri aillse BRD4 agus an E3 ligase Parkin co-cheangailte ri galar Pharkinson, a dhearbh an dà chuid lìonra de phròtain aithnichte agus neo-aithnichte. eadar-obrachadh..Tha comas PDPL gus fo-stratan E3 aithneachadh ann an toinntean mòra pròtain a’ riochdachadh suidheachadh far a bheil feum air aithneachadh luchd-ceangail neo-dhìreach.Chaidh dà fho-fhilleadh parkin neo-aithnichte air an eadar-mheadhanachadh le ubiquitination-proteasome a dhearbhadh nan àite.
Leigheas photodynamic (PDT)19 agus neo-ghnìomhachd laser le taic chromophore (CALI)20, anns am bi irradachadh aotrom le photosensitizers a’ gineadh ocsaidean singilte, comasach air pròtanan targaid a chuir an gnìomh no bàs cealla adhbhrachadh.Leis gur e stuth fìor reactive a th’ ann an ocsaidean singlet le astar sgaoilidh teòiridheach timcheall air 70 nm, faodar smachd a chumail air oxidation cuibhrichte gu farsaingeachd timcheall an photosensitizer.Stèidhichte air a’ bhun-bheachd seo, chuir sinn romhainn ocsaidean singlet a chleachdadh gus bileagan dlùth a choileanadh air iom-fhilltean pròtain ann an ceallan beò.Tha sinn air dòigh-obrach chemoproteomic PDPL a leasachadh gus ceithir gnìomhan a choileanadh: (1) gus gineadh ocsaidean gnìomhach singilte a bhrosnachadh coltach ri dòigh-obrach enzymatic PL;(2) thoir seachad bileagan le fuasgladh ùine air tòiseachadh solais;(3) le atharrachadh (4) Seachain a bhith a’ cleachdadh cofactors endogenous (leithid biotin) gus cùl-fhiosrachadh a lughdachadh, no cleachd ath-bheachdan exogenous a tha gu math draghail (leithid peroxides) gus nochdadh cealla ri cuideam àrainneachd a lughdachadh.
Faodar photosensitizers a roinn ann an dà roinn a’ gabhail a-steach fluorophores le cuideam beag moileciuil (me rose bengal, methylene blue)22 agus pròtanan beaga air an còdachadh gu ginteil (me miniSOG, KillerRed)23.Gus dealbhadh modular a choileanadh, leasaich sinn an àrd-ùrlar PDPL den chiad ghinealach le bhith a’ cur pròtanan photosensitizer (PS) ri POI24,25 (Figear 1a).Nuair a thèid a irradiachadh le solas gorm, bidh ocsaidean singlet a’ oxidachadh fuigheall amino-aigéid nucleophilic proximal, a’ leantainn gu polarity umpolung a tha electrophilic agus a dh’ fhaodas freagairt a bharrachd le nucleophiles probe amine16,17.Tha an probe air a dhealbhadh le làmh alkyne gus ceimigeachd cliogadh a cheadachadh agus a tharraing sìos airson comharrachadh LC/MS/MS.
Dealbh sgeamach de bhileagan iom-fhillteachd pròtain air a mheadhanachadh le miniSOG.Nuair a bhios iad fosgailte do sholas gorm, bidh ceallan a tha a’ cur an cèill miniSOG-POI a’ gineadh ocsaidean singlet, a bhios ag atharrachadh pròtainean eadar-ghnìomhach ach chan e pròtanan neo-cheangailteach.Thathas a’ gabhail a-steach toraidhean eadar-mheadhanach de photooxidation le bileagan sealaidheachd den probe ceimigeach amine gus cuir-ris covalent a chruthachadh.Tha am buidheann alkynyl air an probe ceimigeachd a’ ceadachadh ceimigeachd cliog airson beairteas le bhith a’ tarraing sìos agus an uairsin tomhas LC-MS/MS.b Structar ceimigeach probes amine 1-4.c Mion-sgrùdadh gel flùraiseach riochdachail air comharran proteomic miniSOG-meadhanaichte mitochondrial a’ cleachdadh probes 1-4 agus tomhas coimeasach stèidhichte air gel densitometry.Chaidh an co-mheas comharra-gu-cùl-raon de probes ceimigeach a mheasadh a ’cleachdadh deuchainnean smachd àicheil às aonais solas gorm no a’ cleachdadh ceallan HEK293T às aonais abairt miniSOG.n = 2 shampall neo-eisimeileach gu bith-eòlasach.Tha gach dot a’ riochdachadh mac-samhail bith-eòlasach.d Dearbhadh riochdachail agus tomhas PDPL a’ cleachdadh probe 3 làn-leasaichte an làthair no às aonais nam pàirtean PDPL comharraichte leithid c.n = 3 sampallan neo-eisimeileach gu bith-eòlasach.Tha gach dot a’ riochdachadh mac-samhail bith-eòlasach.Tha centerlines agus whiskers a’ riochdachadh a’ mheadhan agus ± claonadh àbhaisteach.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Ìomhaighean confocal de ocsaidean singilte le stain Si-DMA fada-dhearg.Bàr sgèile: 10 µm.Chaidh ìomhaighean gel agus deuchainnean confocal ath-aithris gu neo-eisimeileach co-dhiù dà uair le toraidhean co-chosmhail.
Rinn sinn deuchainn an-toiseach air comas nam photosensitizers aibidh miniSOG26 agus KillerRed23, air an cur an cèill gu seasmhach ann an HEK293T, gus bileagan propargylamine den proteome a mheadhanachadh mar probe ceimigeach (Fig. 1a Leasachail).Sheall mion-sgrùdadh fluorescence gel gun deach bileagan proteome slàn a choileanadh a’ cleachdadh miniSOG agus irradachadh solais gorm, fhad ‘s nach deach toradh labeling faicsinneach fhaicinn le KillerRed.Gus an co-mheas comharra-gu-cùl a leasachadh, rinn sinn deuchainn an uairsin air seata de probes ceimigeach anns an robh aniline (1 agus 3), propylamine (2), no benzylamine (4).Chunnaic sinn gu robh comharran cùl-fhiosrachaidh nas àirde aig ceallan HEK293T fhèin an taca ri solas gorm, is dòcha mar thoradh air an photosensitizer riboflavin endogenous, flavin mononucleotide (FMN) 27 . Thug probes ceimigeach stèidhichte air aniline 1 agus 3 sònrachas nas fheàrr, le HEK293T gu seasmhach a’ cur an cèill miniSOG ann am mitochondria a’ taisbeanadh àrdachadh> 8-fhillte ann an comharra airson probe 3, fhad ‘s a bha probe 2 air a chleachdadh anns an dòigh labeling RNA CAP-seq a’ taisbeanadh ~ 2.5- a-mhàin. àrdachadh comharran fillte, is dòcha mar thoradh air diofar roghainnean reactivity eadar RNA agus pròtain (Fig. 1b, c). Thug probes ceimigeach stèidhichte air aniline 1 agus 3 sònrachas nas fheàrr, le HEK293T gu seasmhach a’ cur an cèill miniSOG ann am mitochondria a’ taisbeanadh àrdachadh> 8-fhillte ann an comharra airson probe 3, fhad ‘s a bha probe 2 air a chleachdadh anns an dòigh labeling RNA CAP-seq a’ taisbeanadh ~ 2.5- a-mhàin. àrdachadh comharran fillte, is dòcha mar thoradh air diofar roghainnean reactivity eadar RNA agus pròtain (Fig. 1b, c).Sheall probes ceimigeach stèidhichte air aniline 1 agus 3 sònrachas nas fheàrr: tha HEK293T, a tha gu seasmhach a’ cur an cèill miniSOG ann am mitochondria, a’ nochdadh barrachd air àrdachadh 8-fhillte ann an comharra airson probe 3, fhad ‘s a tha probe 2, air a chleachdadh ann an dòigh labeling CAP-seq RNA, a-mhàin a’ sealltainn ~ àrdachadh comharra 2.5-fhillte, is dòcha mar thoradh air diofar roghainnean reactivity eadar RNA agus pròtain (Fig. 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针化学 探针 3 具有和 好 好 好 好 的 的 粒体 粒体 粒体 增加 增加 增加 rna 增加 增加 Rna-seq 的 探针 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示 ~ 2.5 - 倍信号增加, 可能是由 于RNA 和蛋 白质 之 间的不同反应偏好 (图1b, c）).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 - 倍信号增加，可能是由于RNABha sònrachas nas fheàrr aig probes ceimigeach stèidhichte air aniline 1 agus 3, chuir HEK293T an cèill miniSOG gu seasmhach ann am mitochondria, agus bha àrdachadh 8-fhillte aig probe 3 ann an comharra, fhad ‘s a sheall probe 2 airson modh labeling CAP-seq RNA dìreach ~ àrdachadh 2.5 -fold.anns a 'chomharra, is dòcha mar thoradh air roghainnean freagairt eadar-dhealaichte eadar RNA agus pròtain (Fig. 1b, c).A bharrachd air an sin, chaidh isomers probe 3 agus probes hydrazine (probes 5, 6, 7) a dhearbhadh, a’ dearbhadh an ìre as fheàrr de probe 3 (Fig. 1b,c a bharrachd).San aon dòigh, nochd mion-sgrùdadh fluorescence in-gel paramadairean deuchainneach làn-leasaichte eile: tonn-tonn irradachaidh (460 nm), dùmhlachd probe ceimigeach (1 mM), agus ùine irradachaidh (20 min) (Fig. 2a–c Leasachail).Le bhith a' fàgail pàirt no ceum sam bith anns a' phròtacal PDPL thàinig atharrachadh mòr air comharran air a' chùl (Fig. 1d).Gu sònraichte, chaidh bileagan pròtain a lughdachadh gu mòr ann an làthaireachd sodium azide no trolox, a tha fios gu bheil iad a’ cuir às do ocsaidean singilte.Tha làthaireachd D2O, a tha aithnichte gu bhith a’ bunailteachadh ocsaidean singlet, a’ neartachadh a’ chomharra leubail.Gus sgrùdadh a dhèanamh air na tha gnèithean ocsaidean reactive eile a’ cur ri bileagan, chaidh mannitol agus vitimín C a chur ris gus scavengers radical hydroxyl agus superoxide a stèidheachadh, fa leth, 18, 29, ach cha deach an lorg gun lughdaich iad bileagan.Cha do dh'adhbhraich cur-ris H2O2, ach gun soillseachadh, gu bileagan (Fig. 3a a bharrachd).Dhearbh ìomhaighean fluorescence singlet ocsaidean le probes Si-DMA gu robh ocsaidean singlet anns an uèir HEK293T-miniSOG, ach chan ann san uèir HEK293T tùsail.A bharrachd air an sin, cha b’ urrainn do mitoSOX Red cinneasachadh superoxide a lorg às deidh soillseachadh (Fig. 1e agus Fig. 3b Leasachail) 30. Tha an dàta seo a’ moladh gu làidir gur e ocsaidean singlet am prìomh ghnè ocsaidean reactive le uallach airson bileagan proteomic às deidh sin.Chaidh cytotoxicity PDPL a mheasadh a’ toirt a-steach irradachadh solas gorm agus probes ceimigeach, agus cha deach mothachadh sam bith air cytotoxicity sam bith (Fig. 4a a bharrachd).
Gus sgrùdadh a dhèanamh air an uidheamachd labeling agus comharrachadh proteomic de iom-fhilltean pròtain a’ cleachdadh LC-MS / MS, feumaidh sinn an-toiseach faighinn a-mach dè na h-amino-aigéid a tha air an atharrachadh agus an tomad delta de bhileagan probe.Thathas ag aithris gu bheil Methionine, histidine, tryptophan agus tyrosine air an atharrachadh le singlet oxygen14,15.Bidh sinn a’ fighe a-steach sruth-obrach TOP-ABPP31 leis an rannsachadh fosgailte neo-phàirteach a thug an àrd-ùrlar coimpiutaireachd FragPipe seachad stèidhichte air MSFragger32.Às deidh atharrachadh ocsaidean singlet agus bileagan probe ceimigeach, chaidh ceimigeachd cliog a dhèanamh a ’cleachdadh bileag lughdachadh biotin anns an robh ceangal so-ruigsinneach, air a leantainn le sìneadh neutravidin agus cnàmhadh trypsin.Chaidh am peptide atharraichte, a tha fhathast ceangailte ris an roisinn, a dhealbhachadh airson mion-sgrùdadh LC-MS/MS (Figear 2a agus Dàta Leasachail 1).Thachair àireamh mhòr de dh’ atharrachaidhean air feadh an proteome le còrr air 50 maidsean mapa peptide (PSM) air an liostadh (Fig. 2b).Gu h-iongantach, cha do choimhead sinn ach atharrachadh air histidine, is dòcha mar thoradh air an ath-ghnìomhachd nas àirde de histidine oxidized a dh’ ionnsaigh probes aniline na amino-aigéid eile.A rèir an uidheamachd foillsichte de oxidation histidine le singlet ocsaidean, 21,33 tha an structar delta-mass a thathar a’ moladh de +229 Da a’ freagairt ri cur-ris probe 3 le 2-oxo-histidine às deidh dà oxidation, agus is e + 247 Da an toradh hydrolysis de +229 Da (Fig. 5 Leasachail).Sheall measadh air an speactram MS2 àrd earbsa ann an comharrachadh a’ mhòr-chuid de na h-ianan y agus b, a’ toirt a-steach comharrachadh ianan criomag atharraichte (y agus b) (Fig. 2c).Nochd mion-sgrùdadh co-theacsa air an t-sreath ionadail de histidines a chaidh atharrachadh le PDPL gur e roghainn meadhanach motif airson fuigheall beag hydrophobic aig ±1 dreuchdan (Fig. 4b a bharrachd).Gu cuibheasach, chaidh histidines 1.4 a chomharrachadh airson gach pròtain, agus chaidh làraich nan comharran sin a dhearbhadh le farsaingeachd uachdar so-ruigsinneach fuasgladh (SASA) agus mion-sgrùdadh ri fhaighinn air fuasgladh (RSA) (Fig. 4c, d).
Sruth-obrach neo-phàirteach airson a bhith a’ sgrùdadh roghnachd fuigheall a’ cleachdadh àrd-ùrlar coimpiutaireachd FragPipe le cumhachd MSFragger.Bithear a’ cleachdadh luchd-ceangail so-ruigsinneach ann an ceimigeachd Click gus leigeil le photocleavage de pheptidean atharraichte bho roisinn streptavidin.Chaidh sgrùdadh fosgailte a chuir air bhog gus grunn atharrachaidhean a chomharrachadh, a bharrachd air na tha air fhàgail.b Sònraich meud nan atharrachaidhean a tha a’ tachairt air feadh an proteome.Peptide mapadh PSM.c Nota speactram MS2 de làraich histidine air atharrachadh le probe 3. Mar eisimpleir riochdachail, chuir freagairt covalent le probe 3 +229.0938 Da ris an aminoidid atharraichte.d Assay mutation air a chleachdadh gus deuchainn a dhèanamh airson comharran PDPL.Chaidh PRDX3 (H155A, H225A) agus PRDX1 (H10A, H81A, H169A) a ghluasad le plasmids seòrsa fiadhaich airson lorg an-aghaidh na Brataich.e Chaidh am peptide synthetigeach ath-bhualadh le miniSOG fìor-ghlan an làthair probe 3 agus chaidh na toraidhean co-fhreagarrach le Δm +247 agus +229 a thoirt fa-near anns an speactram LC-MS.f Eadar-obrachaidhean pròtain-gu-phròtain in vitro air am modaladh le miniSOG-6xHis-tag agus antibody anti-6xHis.Antibiotin (streptavidin-HRP) agus mion-sgrùdadh blot an-aghaidh luchag an Iar air iom-fhilltean antibody miniSOG-6xHis / anti-6xHis air an ainmeachadh le probe 3, a rèir an ùine a tha e fosgailte don t-solas.Tha bileagan airson pròtanan fa leth air an cur an cèill anns a’ chuideam moileciuil iomchaidh: sèine solais antibody LC, slabhraidh trom antibody HC.Chaidh na deuchainnean sin ath-aithris gu neo-eisimeileach co-dhiù dà uair le toraidhean co-chosmhail.
Airson dearbhadh bith-cheimiceach air an làrach labeling, chaidh PRDX3 agus PRDX1 a chaidh an comharrachadh le mòr-speactrometry atharrachadh bho histidine gu alanine agus an coimeas ri seòrsa fiadhaich ann am measaidhean gluasaid.Sheall toraidhean PDPL gun do lùghdaich am mùthadh bileagan gu mòr (Fig. 2d).Aig an aon àm, chaidh na sreathan peptide a chaidh an comharrachadh anns an sgrùdadh fosgailte a cho-chur agus ath-fhreagairt in vitro le miniSOG fìor-ghlan an làthair probe 3 agus solas gorm, a ’toirt a-mach toraidhean le gluasad mòr de +247 agus +229 Da nuair a lorgar iad le LC-MS (Fig. . 2e).).Gus deuchainn a dhèanamh an gabhadh pròtanan proximal eadar-ghnìomhach a bhith air an ainmeachadh in vitro mar fhreagairt air miniSOG photoactivation, dhealbhaich sinn assay faisg air làimh fuadain le eadar-obrachadh eadar am pròtain miniSOG-6xHis agus antibody monoclonal in vitro an-aghaidh aige (Figear 2f).Anns a’ mheasadh seo, bha dùil againn ri bileagan faisg air làimh de shlabhraidhean trom is aotrom antibody le miniSOG.Gu dearbh, sheall anti-luchag (ag aithneachadh nan slabhraidhean trom agus aotrom de antibody anti-6xHis-label) agus streptavidin Western blots biotinylation làidir de na slabhraidhean trom agus aotrom.Gu sònraichte, mhothaich sinn autobiotinylation miniSOG mar thoradh air an taga 6xHis agus tar-cheanglaichean eadar slabhraidhean aotrom is trom, a dh’ fhaodadh a bhith co-cheangailte ris a ’bheàrn a chaidh a mhìneachadh roimhe eadar lysine agus freagairt proximal 2-oxo-histidine.Ann an co-dhùnadh, tha sinn a’ co-dhùnadh gu bheil PDPL ag atharrachadh histidine ann an dòigh a tha an urra ri faisg air làimh.
B’ e an ath amas a bh’ againn a bhith a’ comharrachadh an proteome subcellular gus deuchainn a dhèanamh air sònraichteachd bileagan in situ.Mar sin, chuir sinn an cèill miniSOG gu seasmhach anns an niuclas, matrix mitochondrial, no membran ER a-muigh de cheallan HEK293T (Fig. 3a).Nochd mion-sgrùdadh fluorescence gel pailteas bannan le bileagan aig trì àiteachan fo-cheallach a bharrachd air diofar phàtranan leubail (Fig. 3b).Sheall mion-sgrùdadh ìomhaighean fluorescence àrd sònraichte de PDPL (Fig. 3c).Chaidh sruth-obrach PDPL a leantainn le ath-bheachdan cliog le dathan rhodamine gus proteomes subcellular a mhìneachadh a ’cleachdadh microscopy fluorescence, agus chaidh comharran PDPL a cho-shuidheachadh le DAPI, lorgairean mitochondrial, no lorgairean ER, a’ dearbhadh dìlseachd àrd PDPL.Airson na trì àiteachan organelle, sheall coimeas taobh ri taobh de PDPL le TurboID a ’cleachdadh avidin western blot gun deach PDPL a chomharrachadh nas mionaidiche an taca ris na smachdan aca.Fo chumhachan PDPL, nochd barrachd chòmhlain le bileag, a’ nochdadh barrachd phròtainean le bileag PDPL (Fig. 6a-d a bharrachd).
riochdachadh sgeamach de bhileag proteome sònraichte organelle-meadhanaichte miniSOG.Bidh miniSOG a ’cuimseachadh air a’ mhaitrix mitochondrial tro bhith a ’ceangal ri amino-aigéid N-terminal 23 de COX4 daonna (mito-miniSOG), an niuclas tro aonachadh gu H2B (nucleus-miniSOG), agus Sec61β tro thaobh cytoplasmic an membran ER (ER-miniSOG). ).Tha comharran a’ toirt a-steach ìomhaighean gel, ìomhaighean confocal, agus tomad spectrometry.b Ìomhaighean gel riochdachail de thrì pròifilean PDPL a tha sònraichte do organelle.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Ìomhaighean confocal riochdachail de cheallan HEK293T gu seasmhach a’ cur an cèill miniSOG le diofar àiteachan subcellular air an lorg le antibody leis an ainm V5 (dearg).Bidh comharran subcellular air an cleachdadh airson mitochondria agus ER (uaine).Tha sruth-obrach PDPL a’ toirt a-steach lorg proteomes subcellular le bileagan miniSOG (buidhe) a’ cleachdadh ceimigeachd cliog Cy3-azide.Bàr sgèile: 10 µm.d Plocan bholcànach de proteomes le tag PDPL ann an grunn organelles air an tomhas le tomhas gun ainm (n = 3 deuchainnean bith-eòlasach neo-eisimeileach).Chaidh deuchainn t Oileanach dà-earball a chleachdadh air plotaichean bholcàno.Chaidh seòrsa fiadhaich HEK293T a chleachdadh mar smachd àicheil. Tha pròtanan air an atharrachadh gu mòr air an comharrachadh ann an dearg (p <0.05 agus> eadar-dhealachadh dian ion dà-fhillte). Tha pròtanan air an atharrachadh gu mòr air an comharrachadh ann an dearg (p <0.05 agus> eadar-dhealachadh dian ion dà-fhillte). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 agus >2-кратная разница в интенсивности). Tha pròtanan air an atharrachadh gu mòr air an comharrachadh ann an dearg (p <0.05 agus> eadar-dhealachadh dà-fhillte ann an dian ian).p <0.05 和> 2 倍离子强度差异） 。p <0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и > 2-кратная разница в ионной сил). Tha pròtanan air an atharrachadh gu mòr air an comharrachadh ann an dearg (p <0.05 agus> eadar-dhealachadh dà-fhillte ann an neart ionic).Tha pròtanan co-cheangailte a tha cudromach airson HEK293T-miniSOG ach nach eil cudromach airson HEK293T air an sealltainn ann an uaine.e Mion-sgrùdadh air sònrachas dàta proteomic bho dheuchainnean d.Tha an àireamh iomlan de phròtainean a tha cudromach gu staitistigeil anns gach organelle (dotagan dearga is uaine) air a chomharrachadh aig a’ mhullach.Tha histograman a’ sealltainn pròtainean ann an organelles stèidhichte air MitoCarta 3.0, mion-sgrùdadh GO agus A. Ting et al.dhaoine.Stòran dàta fa leth airson mitochondria, niuclas, agus ER.Chaidh na deuchainnean sin ath-aithris gu neo-eisimeileach co-dhiù dà uair le toraidhean co-chosmhail.Tha dàta amh air a thoirt seachad ann an cruth faidhlichean dàta amh.
Air a bhrosnachadh leis na toraidhean gel agus ìomhaighean, chaidh tomhas gun leubail a chleachdadh gus an proteome comharraichte anns gach organelle (Dàta Leasachail 2) a thomhas.Chaidh HEK293T neo-ghluasadach a chleachdadh mar smachd àicheil gus comharran cùl-fhiosrachaidh a thoirt air falbh. Sheall mion-sgrùdadh cuilbheart bholcàno pròtanan beairteach gu mòr (p <0.05 agus> dian ian dà-fhillte) a bharrachd air pròtanan singilte nach eil an làthair ach ann an loidhnichean miniSOG-expressing (Fig. 3d dotagan dearga is uaine). Sheall mion-sgrùdadh cuilbheart bholcàno pròtanan beairteach gu mòr (p <0.05 agus> dian ian dà-fhillte) a bharrachd air pròtanan singilte nach eil an làthair ach ann an loidhnichean miniSOG-expressing (Fig. 3d dotagan dearga is uaine). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Sheall mion-sgrùdadh cuilbheart bholcàno pròtanan a bha gu math beairteach (p<0.05 agus> dian ian dà-fhillte) a bharrachd air pròtanan singilte nach eil an làthair ach ann an loidhnichean miniSOG-expressing (Fig. 3d, dotagan dearga is uaine).火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 的 的 蛋白质 (P <0.05 和> 2 倍 强度) 以及 强度 存 中 中 中 中 中 的 蛋白质 红色).火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点。。。）））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Nochd mion-sgrùdadh cuilbheart bholcàno pròtanan a bha gu math beairteach (p<0.05 agus> 2x neart ionic) a bharrachd air pròtanan singilte a-mhàin a tha an làthair anns an loidhne abairt miniSOG (dotagan dearga is uaine ann am Fig. 3d).Le bhith a’ cothlamadh an dàta seo, chomharraich sinn 1364, 461, agus 911 a bha cudromach gu staitistigeil niuclasach, mitochondrial, agus pròtanan membran taobh a-muigh ER, fa leth.Gus mion-sgrùdadh a dhèanamh air cruinneas PDPL organelle-ionadail, chleachd sinn mion-sgrùdadh MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO), agus A. Ting et al.chaidh seata dàta8 a chleachdadh airson mitochondria, niuclas, agus ER gus deuchainn a dhèanamh air sònrachas organelle nam pròtanan a chaidh a lorg, a rèir cruinneas 73.4, 78.5, agus 73.0% (Fig. 3e).Tha sònraichteachd PDPL a’ dearbhadh gu bheil PDPL na inneal air leth freagarrach airson proteomes sònraichte organelle a chomharrachadh.Gu sònraichte, sheall mion-sgrùdadh submitochondrial de phròtainean mitochondrial comharraichte gu robh am proteome glaiste air a chuairteachadh sa mhòr-chuid anns a’ mhaitrix agus an membran a-staigh (226 agus 106, fa leth), a’ dèanamh suas 91.7% (362) den àireamh iomlan de phròtainean mitochondrial a chaidh a chomharrachadh.chaidh ìre àrd de PDPL a dhearbhadh a bharrachd (Fig. 7a a bharrachd).San aon dòigh, sheall mion-sgrùdadh subnuclear gun robh am proteome a chaidh a ghlacadh air a chuairteachadh sa mhòr-chuid anns an niuclas, nucleoplasm, agus nucleolus (Fig. 7b a bharrachd).Sheall mion-sgrùdadh proteomic niuclasach le peptide comharra ionadail niuclasach (3xNLS) cruinneas coltach ris an togalach H2B (Fig. 7c–h a bharrachd).Gus faighinn a-mach dè cho sònraichte sa tha an comharra PDPL, chaidh lamin niùclasach A a thaghadh mar ribe POI7 nas ionadaile.Chomharraich PDPL 36 pròtanan beairteach gu mòr, agus bha 12 pròtainean (30.0% a’ toirt a-steach lamin A) nam pròtanan eadar-ghnìomhach lamin A le deagh chomharra air an comharrachadh le stòr-dàta String, le ceudad nas àirde na an dòigh BioID (122 pròtanan) 28 de 28. , 22.9 %) 7. Chomharraich an dòigh-obrach againn nas lugha de phròtainean, is dòcha air sgàth raointean labeling cuibhrichte, a chaidh a dhèanamh comasach le ocsaidean singlet nas gnìomhaiche.Sheall mion-sgrùdadh GO gu robh na pròtanan comharraichte suidhichte sa mhòr-chuid anns an nucleoplasm (26), membran niùclasach (10), membran niùclasach (9), agus pores niùclasach (5).Còmhla, bha na pròtanan ionadail-niùclasach sin a’ dèanamh suas 80% de na pròtanan beairteach, a’ nochdadh tuilleadh sònraichteachd PDPL (Fig. 8a–d a bharrachd).
Às deidh dhuinn comas PDPL a stèidheachadh gus comharrachadh faisg air làimh a dhèanamh ann an organelles, rinn sinn deuchainn an uairsin an gabhadh PDPL a chleachdadh gus com-pàirtichean ceangail POI a sgrùdadh.Gu sònraichte, dh’ fheuch sinn ri mion-sgrùdadh PDPL de phròtainean cytosolic a mhìneachadh, a tha air am meas mar thargaidean nas duilghe na an co-aoisean ionadail membran air sgàth an nàdur fìor bheothail.Tha am pròtain bromodomain agus extraterminal (BET) BRD4 air ar n-aire a tharraing airson a phrìomh àite ann an grunn ghalaran 35, 36 .Tha an toinnte a chaidh a chruthachadh le BRD4 na cho-ghnìomhaiche tar-sgrìobhaidh agus na thargaid teirpeach cudromach.Le bhith a’ riaghladh an abairt de fhactaran tar-sgrìobhaidh c-myc agus Wnt5a, thathas den bheachd gu bheil BRD4 na phrìomh neach-dearbhaidh air leucemia myeloid acute (AML), myeloma ioma-fhillte, lymphoma Burkitt, aillse coloin agus galairean inflammatory37,38.A bharrachd air an sin, tha cuid de bhìorasan ag amas air BRD4 gus tar-sgrìobhadh viral agus ceallach a riaghladh, leithid papillomavirus, HIV, agus SARS-CoV-236,39.
Gus eadar-obrachadh BRD4 a mhapadh a’ cleachdadh PDPL, chuir sinn còmhla miniSOG le isoform goirid N- no C-terminal de BRD4.Nochd toraidhean proteomic ìre àrd de thar-tharraing eadar an dà thogalach (Fig. 9a a bharrachd).Tha am proteome niùclasach a chaidh a chomharrachadh le miniSOG-H2B a’ còmhdach 77.6% de na pròtanan a tha ag eadar-obrachadh le BRD4 (Fig. 9b a bharrachd).An uairsin, chaidh amannan soilleireachaidh eadar-dhealaichte (2, 5, 10, 20 min) a chleachdadh gus an radius comharrachaidh atharrachadh (Fig. 4a agus dàta leasachail 3).Tha sinn a’ co-dhùnadh, aig photoperiods nas giorra, gum bi PDPL gu sònraichte a’ comharrachadh com-pàirtichean ceangail dìreach, fhad ‘s a bhios amannan nas fhaide a’ toirt a-steach pròtanan a chaidh an comharrachadh aig amannan togail dhealbhan nas giorra a bharrachd air targaidean neo-dhìreach ann an ionadan labeling.Gu dearbh, lorg sinn tar-lùbadh làidir eadar puingean ùine faisg air làimh (84.6% airson 2 agus 5 min; 87.7% airson 5 agus 10 min; 98.7% airson 10 agus 20 min) (Fig. 4b agus Fig. 9c a bharrachd).Anns a h-uile buidheann deuchainneach, lorg sinn chan e a-mhàin fèin-labeling BRD4, ach grunn thargaidean aithnichte leithid MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, agus HMGB1 le notaichean anns an stòr-dàta sreang.Tha neart ionic nan targaidean sin co-rèireach ris an ùine nochdaidh (Fig. 4c agus Fig. 9d).Sheall mion-sgrùdadh GO de na pròtanan a chaidh a chomharrachadh anns a’ bhuidheann 2-mionaid gu robh na pròtanan comharraichte air an suidheachadh gu h-ionadail anns a’ niuclas agus gu robh iad an sàs ann an ath-dhealbhadh chromatin agus gnìomh RNA polymerase.Chaidh gnìomh moileciuil a’ phròtain a neartachadh ann an ceangal cromatin no co-ghnìomhachadh tar-sgrìobhaidh, a rèir gnìomh BRD4 (Fig. 4d).Nochd mion-sgrùdadh eadar-obrachadh pròtain le comas stòr-dàta sreath a’ chiad ìre de eadar-obrachaidhean neo-dhìreach eadar ionadan eadar-obrachaidh teaghlaich BRD4 agus HDAC leithid SIN3A, NCOR2, BCOR, agus SAP130 (Fig. 4e agus Fig. ..A bharrachd air an sin, chaidh targaidean riochdachail a chaidh an comharrachadh le LC-MS/MS, a’ gabhail a-steach Sin3A, NSUN2, Fus, agus SFPQ, a dhearbhadh le Western blotadh (Fig. 4f).O chionn ghoirid, chaidh aithris gu bheil an isoform goirid de BRD4 a’ cruthachadh nuclei le feartan dealachadh ìre lionn-leaghaidh (LLPS).Bidh na pròtanan ceangail RNA Fus agus SFPQ a’ meadhanachadh LLPS de dhiofar phròiseasan cealla agus chaidh an comharrachadh an seo mar phròtainean ceangail BRD4 neo-chlàraichte.Chaidh an eadar-obrachadh eadar BRD4 agus SFPQ a dhearbhadh le deuchainnean co-immunoprecipitation (co-IP) (Figear 4g), a’ moladh dòigh eile airson dealachadh ìre lionn-leaghaidh le meadhan BRD4 a tha airidh air tuilleadh sgrùdaidh.Air an gabhail còmhla, tha na toraidhean sin a’ moladh gu bheil PDPL na àrd-ùrlar air leth freagarrach airson eadar-obrachadh BRD4 aithnichte a chomharrachadh a bharrachd air pròtanan ceangail neo-aithnichte.
riochdachadh sgeamach de chomharradh faisg air BRD4 le meadhan miniSOG, amannan nochdaidh: 2, 5, 10, agus 20 min.b Tar-tharraing pròtainean air an comharrachadh aig diofar amannan soillseachaidh.Bha beairteas pròtain a chaidh a chomharrachadh ann an HEK293T-miniSOG-BRD4 cudromach gu staitistigeil an taca ri seòrsa fiadhaich HEK293T.c Dìth ian nuair a thathar a’ tomhas pròtainean ceangail BRD4 aithnichte le riochdaire rè na h-ùine nochdaidh ainmichte.n = 3 sampallan neo-eisimeileach gu bith-eòlasach.Tha dàta air a thaisbeanadh mar mheadhan ± claonadh àbhaisteach.d Mion-sgrùdadh ontologach gine (GO) de phròtainean a chaidh an comharrachadh sa bhuidheann 2-mionaid.Tha a’ chiad deich teirmean GO air an liostadh.Tha builgeanan air an dath a rèir roinn teirm GO, agus tha meud builgean a rèir an àireamh de phròtainean a lorgar anns gach teirm.e Mion-sgrùdadh sreang air pròtanan ag eadar-obrachadh le BRD4.Tha na cearcallan buidhe nan glaodh dìreach agus is e na cearcallan glasa a’ chiad sreath de ghlaodh neo-dhìreach.Tha na loidhnichean dearga a’ riochdachadh na h-eadar-obrachaidhean a chaidh a dhearbhadh gu deuchainneach agus tha na loidhnichean gorma a’ riochdachadh na h-eadar-obrachaidhean a thathar an dùil.f Chaidh targaidean ceangail BRD4 riochdachail a chaidh an comharrachadh ann an LC-MS/MS a dhearbhadh le blotting an Iar.g Bidh deuchainnean co-immunoprecipitation a’ dearbhadh an eadar-obrachadh eadar SFPQ agus BRD4.Chaidh na deuchainnean sin ath-aithris gu neo-eisimeileach co-dhiù dà uair le toraidhean co-chosmhail.Tha dàta amh air a thoirt seachad ann an cruth faidhlichean dàta amh.
A bharrachd air a bhith a’ comharrachadh thargaidean neo-chlàraichte co-cheangailte ri POI, tha sinn a’ gabhail beachd gum bi PDPL freagarrach airson fo-stratan a chomharrachadh airson enzyman, a dh’ fheumadh comharrachadh pròtainean ceangail neo-dhìreach ann an toinntean mòra gus fo-stratan neo-chlàraichte a chomharrachadh.Is e ligase E3 a th’ ann am Parkin (air a chòdachadh le PARK2) agus tha fios gu bheil mùthaidhean ann am parkin ag adhbhrachadh galar Pharkinson òganach cùil fèin-ghluasadach (AR-JP)42.A bharrachd air an sin, tha parkin air a mhìneachadh mar rud riatanach airson mitophagy (autophagy mitochondrial) agus toirt air falbh gnèithean ocsaidean reactive.Ach, ged a chaidh grunn fo-stratan parkin a chomharrachadh, chan eil e soilleir dè an àite a th’ aig parkin anns a’ ghalair seo.Gus na fo-stratan neo-chomharraichte aca a chomharrachadh, chaidh PDPL a dhearbhadh le bhith a’ cur miniSOG ris an N- no C-terminus parkin.Chaidh dèiligeadh ri ceallan leis a’ ghiùlan proton carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) gus parkin a chuir an gnìomh tron ​​​​t-slighe PINK1-Parkin.An coimeas ris na toraidhean BRD4 PDPL againn, nochd parkin N-terminus fusion seata nas motha de phròtainean targaid, ged a bha e a’ còmhdach cuibhreann nas motha den C-terminus (177 a-mach à 210) (Figear 5a, b agus Dàta Leasachail 4).tha an toradh co-chòrdail ri aithisgean gum faod tagaichean N-terminal Parkin44 a chuir an gnìomh gu mì-fhortanach.Gu h-iongantach, cha robh ach 18 pròtainean a’ dol thairis air an dàta againn le toraidhean AP-MS foillsichte airson Parkin43, is dòcha mar thoradh air eadar-dhealachaidhean eadar loidhnichean cealla agus sruthan obrach proteomics.A bharrachd air ceithir pròtanan aithnichte (ARDM1, HSPA8, PSMD14, agus PSMC3) air an comharrachadh le dà dhòigh (Fig. 5c)43.Gus toraidhean LC-MS / MS a dhearbhadh tuilleadh, chaidh làimhseachadh PDPL agus blotting an Iar às deidh sin a chleachdadh gus coimeas a dhèanamh eadar toraidhean assay pàrant cealla HEK293T agus an loidhne pàirceidh N-terminal seasmhach.Chaidh targaidean neo-aithnichte roimhe CDK2, DUT, CTBP1, agus PSMC4 a dhearbhadh le inneal-ceangail aithnichte, DNAJB1 (Fig. 5d).
Cuilbheart bholcàno de phròtainean eadar-ghnìomhach parkin ann an ceallan HEK293T le miniSOG air a chuir an cèill gu seasmhach ceangailte ri ceann-uidhe N- no C parkin (n = 3 deuchainnean bith-eòlasach neo-eisimeileach).Chaidh deuchainn t Oileanach dà-earball a chleachdadh air plotaichean bholcàno.Chaidh HEK293T a chleachdadh mar smachd àicheil. Tha pròtanan air an atharrachadh gu mòr air an comharrachadh ann an dearg (p <0.05 agus> eadar-dhealachadh dian ion dà-fhillte). Tha pròtanan air an atharrachadh gu mòr air an comharrachadh ann an dearg (p <0.05 agus> eadar-dhealachadh dian ion dà-fhillte). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 agus >2-кратная разница в интенсивности). Tha pròtanan air an atharrachadh gu mòr air an comharrachadh ann an dearg (p <0.05 agus> eadar-dhealachadh dà-fhillte ann an dian ian).p <0.05 和> 2 倍离子强度差异） 。p <0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и > 2-кратная разница в ионной сил). Tha pròtanan air an atharrachadh gu mòr air an comharrachadh ann an dearg (p <0.05 agus> eadar-dhealachadh dà-fhillte ann an neart ionic).Tha pròtanan co-cheangailte a tha cudromach airson HEK293T-miniSOG ach nach eil cudromach airson HEK293T air an sealltainn ann an uaine.b Diagram Venn a’ sealltainn pròtanan a tha a’ dol an lùib a chèile eadar structaran N-terminal agus C-terminal.Faodaidh tagaichean N-terminal parkin a chuir an gnìomh gu mì-mhodhail agus leantainn gu pròtanan nas aithnichte.c Diagram Venn a’ sealltainn pròtainean a’ dol thairis air eadar PDPL agus AP-MS.Tha luchd-eadar-obrachaidh aithnichte air an liostadh, a’ toirt a-steach 4 de 18 pròtainean a tha a’ dol thairis air agus 11 de phròtainean 159 a chaidh an comharrachadh gu sònraichte ann am PDPL.d Chaidh targaidean riochdachail a chaidh an comharrachadh le LC-MS/MS a dhearbhadh le blotting an Iar.Chaidh e Ssu72 agus SNW1 a chomharrachadh mar fho-stratan parkin neo-chlàraichte.Chaidh na plasmids pròtain seo le tag FLAG a ghluasad gu HEK293T agus HEK293T-Parkin-miniSOG agus an uairsin làimhseachadh CCCP aig diofar amannan.Bha an truailleadh nas fhollaisiche ann an loidhne cus cuideam Parkin.f A’ cleachdadh an neach-dìon proteasome MG132, chaidh a dhearbhadh gu bheil pròiseas truaillidh Ssu72 agus SNW1 air a mheadhanachadh le proteasome-ubiquitination.Chaidh na deuchainnean sin ath-aithris gu neo-eisimeileach co-dhiù dà uair le toraidhean co-chosmhail.Tha dàta amh air a thoirt seachad ann an cruth faidhlichean dàta amh.
Gu sònraichte, feumaidh na pròtanan a dh’ ainmich PDPL a bhith a’ toirt a-steach pròtanan ceangail pàirce agus na fo-stratan aca.Gus fo-stratan parkin neo-chlàraichte a lorg, thagh sinn seachd pròtanan comharraichte (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 agus SNW1) agus plasmids air an tar-chuir gus na ginean sin a nochdadh gu HEK293T àbhaisteach agus gu seasmhach a’ cur an cèill miniSOG-Parkin’s HEK293T le làimhseachadh CCCP.Chaidh na h-ìrean de phròtainean Ssu72 agus SNW1 a lùghdachadh gu mòr ann an loidhne seasmhach miniSOG-Parkin (Fig. 5e).Mar thoradh air làimhseachadh le CCCP airson 12 uair a thìde thàinig an ìsleachadh as cudromaiche den dà fho-strat.Gus sgrùdadh a dhèanamh a bheil truailleadh Ssu72 agus SNW1 air a riaghladh le proteasome-ubiquitination, chaidh an neach-dìon proteasome MG132 a chuir ris gus casg a chuir air gnìomhachd proteasome, agus gu dearbh lorg sinn gu robh am pròiseas truaillidh aca air a bhacadh (Fig. 5f).Chaidh targaidean neo-fho-stàit a bharrachd a dhearbhadh mar luchd-eadar-obrachaidh Parkin a’ cleachdadh Western blotting (Fig. 10 Leasachail), a sheall toraidhean cunbhalach le LC-MS/MS.Gu crìch, tha amalachadh sruth-obrach PDPL le dearbhadh tar-chuir pròtain targaid a’ ceadachadh fo-stratan ligase E3 neo-chlàraichte a chomharrachadh.
Tha sinn air àrd-ùrlar comharrachaidh faisg air làimh a leasachadh a leigeas leat POIs eadar-ghnìomhach a chomharrachadh ann an àite agus ùine.Tha an àrd-ùrlar stèidhichte air pròtain photosensitizer miniSOG, nach eil ach mu 12 kDa, nas lugha na leth meud an enzyme APEX2 aibidh (27 kDa) agus trian de mheud TurboID (35 kDa).Bu chòir don mheud nas lugha leudachadh gu mòr air an raon de thagraidhean airson a bhith a’ sgrùdadh eadar-ghnìomhachasan pròtain beaga.Tha feum air tuilleadh sgrùdaidh air photosensitizers a bharrachd, ge bith an ann pròtanan air an còdachadh gu ginteil no moileciuilean beaga, gus toradh cuantamach de ocsaidean singilte àrdachadh agus cugallachd an dòigh-obrach seo a leudachadh.Airson an dreach gnàthach de miniSOG, faodar fuasgladh ùineail àrd a choileanadh le bhith a ’cleachdadh soillseachadh gorm gus comharran faisg air làimh a chuir an gnìomh.A bharrachd air an sin, leig ùine nochdaidh nas fhaide a-mach “sgòth” nas motha de ocsaidean singlet, a’ leantainn gu atharrachadh air fuigheall histidine nas fhaide air falbh, radius labeling nas motha, agus an comas fuasgladh spàsail PDPL a ghleusadh.Rinn sinn deuchainn cuideachd air seachd probes ceimigeach gus an co-mheas comharra-gu-cùl-raon àrdachadh agus rannsaich sinn an uidheamachd moileciuil air cùl an dòigh-obrach seo.Dhearbh sruth-obrach TOP-ABPP còmhla ri sgrùdadh fosgailte neo-chlaonach nach do thachair atharrachaidhean ach ann an histidines agus cha deach meanbh-àrainneachd cunbhalach a choimhead airson barrachd atharrachaidhean histidine, ach a-mhàin roghainn meadhanach airson histidines anns an roinn lùb.
Chaidh PDPL a chleachdadh cuideachd gus proteomes subcellular a chomharrachadh le sònraichteachd proteome agus còmhdach co-dhiù an coimeas ri bileagan faisg air làimh eile agus dòighean sgrùdaidh ceimigeach sònraichte organelle.Chaidh comharran faisg air làimh a chleachdadh gu soirbheachail cuideachd gus an uachdar, lysosomal, agus proteomes co-cheangailte ri secretome46,47 a chomharrachadh.Tha sinn den bheachd gum bi PDPL co-chòrdail ris na h-organelles subcellular sin.A bharrachd air an sin, thug sinn dùbhlan do PDPL le bhith a’ comharrachadh thargaidean airson ceangal pròtain cytosolic a tha nas iom-fhillte na pròtanan ceangailte ri membran air sgàth am feartan fiùghantach agus an sàs ann an eadar-obrachaidhean nas ùineail.Chaidh PDPL a chuir an sàs ann an dà phròtain, an coactivator tar-sgrìobhaidh BRD4 agus an ligase E3 Parkin co-cheangailte ri galair.Chaidh an dà phròtain seo a thaghadh chan ann a-mhàin airson na gnìomhan bith-eòlasach bunaiteach aca, ach cuideachd airson am buntainneachd clionaigeach agus an comas teirpeach.Airson an dà POIs seo, chaidh com-pàirtichean ceangail ainmeil a bharrachd air targaidean neo-chlàraichte a chomharrachadh.Gu sònraichte, chaidh am pròtain co-cheangailte ri sgaradh ìre SFPQ a dhearbhadh le co-IP, a dh’ fhaodadh a bhith a ’nochdadh uidheamachd ùr leis am bi BRD4 (isoform goirid) a’ riaghladh LLPS.Aig an aon àm, tha sinn den bheachd gu bheil comharrachadh substrates Parkin na shuidheachadh far a bheil feum air adhesives neo-dhìreach a chomharrachadh.Chomharraich sinn dà fho-strat parkin neo-aithnichte agus dhearbh sinn gu robh iad a’ dol sìos air an t-slighe ubiquitination-proteasome.O chionn ghoirid, chaidh ro-innleachd glacaidh stèidhichte air uidheamachd a leasachadh gus fo-stratan hydrolase a lorg le bhith gan glacadh le enzyman.Ged is e dòigh fìor chumhachdach a tha seo, chan eil e freagarrach airson mion-sgrùdadh air fo-stratan a tha an sàs ann a bhith a’ cruthachadh toinntean mòra agus feumaidh e ceanglaichean covalent a chruthachadh eadar an enzyme agus an substrate.Tha sinn an dùil gun gabh PDPL a leudachadh gus sgrùdadh a dhèanamh air iom-fhilltean pròtain eile agus teaghlaichean einnsein, leithid na teaghlaichean deubiquitinase agus metalloprotease.
Chaidh cruth ùr de miniSOG, ris an canar SOPP3, a leasachadh le cinneasachadh ocsaidean singlet nas fheàrr.Rinn sinn coimeas eadar miniSOG agus SOPP3 agus lorg sinn coileanadh comharrachaidh nas fheàrr, ged a dh’ fhan an co-mheas comharra-gu-fuaim gun atharrachadh (Fig. 11 Leasachail).Bha sinn a’ smaoineachadh gun toireadh optimization de SOPP3 (me, tro mean-fhàs stiùirichte) gu pròtanan photosensitizer nas èifeachdaiche a dh’ fheumas amannan solais nas giorra agus mar sin leigeadh le pròiseasan cealla nas beothaile a bhith air an glacadh.Gu sònraichte, tha an dreach gnàthach de PDPL cuingealaichte ris an àrainneachd cealla oir tha feum air soillseachadh solais gorm agus chan urrainn dha a dhol a-steach do fhigheagan domhainn.Tha am feart seo a’ cur casg air a chleachdadh ann an sgrùdaidhean mhodail bheathaichean.Ach, dh’ fhaodadh an cothlamadh de optogenetics le PDPL cothrom a thoirt airson sgrùdadh bheathaichean, gu sònraichte san eanchainn.A bharrachd air an sin, bidh photosensitizers infridhearg innleadaireachd eile cuideachd a ’toirt air falbh a’ chuingealachadh seo.Tha rannsachadh a’ dol air adhart san raon seo an-dràsta.
Chaidh loidhne cealla HEK293T fhaighinn bho ATCC (CRL-3216).Rinn an loidhne cealla deuchainn àicheil airson galar mycoplasma agus chaidh a chultarachadh ann an DMEM (Thermo, #C11995500BT) le taic bho 10% serum bò fetal (FBS, Vistech, #SE100-B) agus 1% penicillin / streptomycin (Hyclone, #SV30010).air fàs ann.
Chaidh 3-Aminophenylene (sampall 3) agus (4-ethynylphenyl) methanamine (sampall 4) a cheannach bho Bidepharm.Chaidh propylamine (probe 2) a cheannach bho Energy-chemicals.Chaidh N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (probe 1) a cho-chur a rèir modhan foillsichte.
Tha Clàr Leasachail 1 a’ liostadh na structaran ginteil a chaidh a chleachdadh san sgrùdadh seo.Chaidh na sreathan miniSOG agus KillerRed a chlò-bhualadh bho plasmid tiodhlac bho P. Zou (Oilthigh Peking).Thàinig an t-sreath targaid matrix mitochondrial bho na h-amino-aigéid 23 N-terminal de COX4 agus chaidh a chlò-bhualadh a-steach do na vectaran comharraichte a ’cleachdadh co-chruinneachadh Gibson (Beyotime, #D7010S).Gus cuimseachadh air membran agus niuclas an reticulum endoplasmic, SEC61B DNA daonna (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) air a mheudachadh le PCR bho leabharlann cDNA de cheallan HEK293T, agus H2B DNA (air a thoirt seachad le D. Lin, Obair-lann Bàgh Shenzhen) agus air an clonadh, mar a chaidh ainmeachadh gu h-àrd.Mura h-eilear ag ràdh a chaochladh, chaidh ginean pròtain eile a chaidh a chleachdadh airson gluasad agus togail loidhnichean cealla seasmhach àrdachadh PCR bho leabharlann cDNA cealla HEK293T.Chaidh G3S (GGGS) agus G4S (GGGGS) a chleachdadh mar luchd-ceangail eadar am pròtain biathadh agus miniSOG.Chaidh taga epitope V5 (GKPIPNPLLGLDST) a chur ris na togalaichean fusion sin.Airson faireachdainn ann am mamalan agus gus loidhne cealla seasmhach a stèidheachadh, chaidh an togail fusion miniSOG a chuir a-steach don vectar lentiviral pLX304.Airson abairt bacterial, chaidh miniSOG a chlò-bhualadh a-steach don vectar pET21a leis an ainm 6xHis aig an C-terminus.
Chaidh ceallan HEK293T a shìolachadh aig ceallan 2.0 x 105 gach tobar ann an truinnsearan sia-tobar agus air an gluasad thairis air 24 uairean às deidh sin le plasmids lentiviral ath-chuingealaichte (2.4 μg pLX304) agus plasmids pacaidh viral (1.5 μg psPAX2 agus 1.2 μg pLX300) a’ cleachdadh Lipoyo. , #C0533), timcheall air 80% fusion.Às deidh tar-chuir thar oidhche, chaidh am meadhan atharrachadh agus a bhrosnachadh airson 24 uair eile.Chaidh cruinneachadh a’ bhìoras a dhèanamh às deidh 24, 48 agus 72 uairean.Mus deach na loidhnichean cealla targaid a ghlacadh, chaidh am meadhan viral a shìoladh tro chriathrag 0.8 μm (Merck, #millex-GP) agus chaidh polybrene (Solarbio, #H8761) a chur ri dùmhlachd de 8 μg / ml.Às deidh 24 uairean, bha cead aig na ceallan faighinn air ais le bhith ag atharrachadh am meadhan.Chaidh ceallan a thaghadh a’ cleachdadh 5 μg / ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) airson a’ chiad trì earrannan mar thaghadh nas teinne.An uairsin chleachdar 20 μg/ml mar dhòigh-obrach nas cruaidhe airson na trì earrannan a tha romhainn.
Chaidh ceallan a shìolachadh ann an seòmraichean 12-tobar (Ibidi, #81201) aig dùmhlachd de mu 20,000 cealla gach tobar.Gus gèilleadh ceallan HEK293T a leasachadh, cuir 50 µg / ml fibronectin (Corning, #356008) air a lagachadh ann an saline buffered fosfáit (PBS, Sangon, #B640435) aig 37 ° C.Chaidh na seòmraichean a làimhseachadh ro-làimh airson 1 uair agus an uairsin a thoirt air falbh le PBS.Às deidh 24 h, chaidh ceallan a nighe aon uair le PBS, air an gortachadh le probe 1 mM 3 ann am fuasgladh salainn cothromach Hanks (HBSS, Gibco, # 14025092) airson 1 h aig 37 ° C, agus an uairsin air a bhrosnachadh le LED gorm (460 nm). ).) air an irradachadh airson 10 mionaidean aig teòthachd an t-seòmair.Às deidh sin, chaidh na ceallan a nighe dà uair le PBS agus an suidheachadh le 4% formaldehyde ann am PBS (Sangon, #E672002) airson 15 mionaidean aig teòthachd an t-seòmair.Chaidh cus formaldehyde a thoirt air falbh bho cheallan stèidhichte le bhith a’ nighe trì tursan le PBS.Chaidh ceallan an uairsin a ghluasad le 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) ann am PBS agus an nighe 3 tursan le PBS.An uairsin thoir air falbh an seòmar agus cuir ris gach sampall 25 µl de mheasgachadh ath-bhualadh cliog anns a bheil 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4 ) agus 0.5 mg/ml sodium ascorbate (Aladdin, àireamh S105024) agus air a ghèilleadh airson 30 mionaid aig teòthachd an t-seòmair.Às deidh freagairt snap, chaidh ceallan a nighe sia tursan le PBS anns an robh 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) agus an uairsin chaidh am bacadh le 5% BSA (Abcone, #B24726) ann am PBST airson 30 mionaid aig teòthachd an t-seòmair.
Airson dìonachd colocalization, chaidh ceallan a bhrosnachadh le prìomh antibodies a rèir nan cumhachan comharraichte: luchag anti-V5 tag mAb (1: 500, CST, #80076), coineanach anti-Hsp60 mAb (1: 1000), ABclonal, #A0564), antibody polyclonal anti-calnexin coineanach (1: 500, Abcam, #ab22595) no antibody monoclonal anti-lamin A/C coineanach (1: 500; CST, #2032) aig 4 ° C thar oidhche.Às deidh dhaibh a bhith a’ nighe 3 tursan le PBST, chaidh ceallan a bhrosnachadh le antibodies àrd-sgoile: gobhar an-aghaidh coineanach Alexa Fluor 488 (Thermo, # A11034) caolachadh 1: 1000, gobhar an-aghaidh luchag Alexa Fluor 594 (CST, #8889) air a lagachadh 1:1000.caolachadh Caolaich aig teòthachd an t-seòmair airson 30 mionaid.Chaidh ceallan an uairsin a nighe 3 tursan le PBST agus an cuir an-aghaidh DAPI (Thermo, #D1306) ann am PBS airson 10 mionaidean aig teòthachd an t-seòmair.Às deidh 3 nighe le PBS, chaidh ceallan a sheulachadh ann an 50% glycerol (Sangon, #A600232) ann am PBS airson ìomhaighean.Chaidh ìomhaighean immunofluorescent fhaighinn a’ cleachdadh miocroscop confocal ZEISS LSM 900 Airyscan2 agus bathar-bog ZNE 3.5.
Airson ìomhaighean fluorescent ocsaidean singlet, chaidh ceallan a nighe dà uair le bufair Hanks HEPES mus cuir iad 100 nM Si-DMA ann am bufair Hanks HEPES (DOJINDO, #MT05).Às deidh dhaibh a bhith fosgailte do sholas, chaidh na ceallan a ghluasad ann an guir CO2 aig 37 ° C airson 45 mionaidean.Chaidh ceallan an uairsin a nighe dà uair le bufair HEPES Hanks agus an cuir an-aghaidh bufair HEPES Hoechst ann an Hanks airson 10 mionaidean aig teòthachd an t-seòmair agus an sealladh le bhith a’ cleachdadh miocroscop confocal ZEISS LSM 900., # M36008) ann am bufair HBSS anns a bheil calcium agus magnesium.Às deidh dhaibh a bhith fosgailte do sholas no doxorubicin (MCE, #HY-15142A), chaidh ceallan a ghluasad ann an goireadair CO2 aig 37 ° C. airson 10 mionaidean, an nighe dà uair le bufair HBSS, agus an gortachadh le Hoechst ann am bufair HBSS aig teòthachd an t-seòmair.mionaidean.Chaidh Doxorubicin a chleachdadh mar smachd dearbhaidh dearbhach far an deach dèiligeadh ri ceallan le 20 μM doxorubicin ann an HBSS anns an robh 1% BSA airson 30 min.Chaidh ìomhaighean immunofluorescent fhaighinn a’ cleachdadh miocroscop confocal Zeiss LSM 900.
Chaidh ceallan HEK293T a chuir an cèill gu seasmhach mito-miniSOG a shìolachadh aig dùmhlachd timcheall air 30% ann an soithichean 15 cm.Às deidh 48 uairean, nuair a ruigeadh ~ 80% comar, chaidh na ceallan a nighe aon uair le PBS, an toirt a-steach le 1 mM Probe 3 ann am bufair HBSS ùr a-steach airson 1 uair aig 37 ° C agus an uairsin air a shoilleireachadh le LED gorm airson 10 mionaidean san t-seòmar teòthachd..Às deidh sin, chaidh na ceallan a nighe dà uair le PBS, an sgrìobadh agus an ath-chuairteachadh ann am bufair PBS fuar-deighe anns an robh luchd-dìon protease gun EDTA (MCE, #HY-K0011).Chaidh ceallan a chuir a-steach le bhith a’ sonicating a ’phut airson 1 mionaid (1 diog air adhart agus 1 diog dheth aig leudachd 35%).Chaidh am measgachadh a thàinig às a sin a mheadhanachadh aig 15,871 xg airson 10 min aig 4 ° C gus sprùilleach a thoirt air falbh, agus chaidh an dùmhlachd supernatant atharrachadh gu 4 mg / mL a’ cleachdadh pasgan assay pròtain BCA (Beyotime, #P0009).Cuir còmhla 1 ml den lysate gu h-àrd le biotin azide 0.1 mM photodegradable (Confluore, #BBBD-14), TCEP 1 mM (Sangon, #A600974), 0.1 mM TBTA ligand (Aladdin, #T162437), agus 1 mM CuSO4 le bonn cuairteachadh suas airson 1 uair aig teòthachd an t-seòmair.Às deidh freagairt snap, cuir am measgachadh ris an fhuasgladh ro-mheasgaichte (MeOH: CHCl3: H2O = 4 ml: 1 ml: 3 ml) ann am vial glainne 10 ml.Bha na sampallan measgaichte agus air an centrifuged aig 4500 g airson 10 mionaidean aig teòthachd an t-seòmair.Chaidh na fuasglaidhean ìosal is àrd a chuir air falbh, chaidh an sileadh a nighe dà uair le 1 ml de methanol agus centrifuged aig 15871 × g airson 5 min aig 4 ° C.Cuir 1 ml de 8 M urea (Aladdin, àireamh. U111902) ann an ammonium bicarbonate 25 mM (ABC, Aladdin, àireamh. A110539) gus an sileadh a sgaoileadh.Chaidh sampaill ath-chruthachadh le 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 ann an 25 mM ABC) airson 40 mionaid aig 55 ° C agus an uairsin chaidh iodoacetamide ùr 15 mM (Sangon, #A600539) a chuir ris aig teòthachd an t-seòmair anns an dorchadas.Alkylation taobh a-staigh 30 mionaid..Chaidh dithiothreitol 5 mM a bharrachd a chuir ris gus stad a chuir air an ath-bhualadh.Ullaich timcheall air 100 µl NeutrAvidin grìogagan agarose (Thermo, #29202) airson gach sampall le bhith a’ nighe 3 tursan le 1 ml PBS.Chaidh am fuasgladh proteome gu h-àrd a lagachadh le 5 ml PBS agus a thoirt a-steach le grìogagan agarose NeutrAvidin ro-nighe airson 4 uairean aig teòthachd an t-seòmair.Chaidh na grìogagan an uairsin a nighe 3 tursan le 5 ml PBS anns a bheil 0.2% SDS (Sangon, #A600485), 3 tursan le 5 ml PBS anns a bheil 1M urea, agus 3 tursan le 5 ml ddH2O.Chaidh na grìogagan an uairsin a bhuain le centrifugation agus ath-chuir a-steach ann an 200 μl de 25 mM ABC anns an robh 1 M urea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) agus 20 ng / μl trypsin (Promega, # V5280).Trypsinize thar oidhche aig 37 ° C le cuairteachadh.Chaidh stad a chuir air an ath-bhualadh le bhith a’ cur searbhag formic (Thermo, # A117-50) ris gus an ruigeadh am pH 2-3.Chaidh na grìogagan a nighe 3 tursan le 1 ml de PBS anns a bheil 0.2% SDS, 3 tursan le 1 ml de PBS anns a bheil 1 M urea, agus an uairsin 3 tursan le 1 ml de uisge grùide.Chaidh na peptides atharraichte a leigeil ma sgaoil le lysis aotrom (365 nm) airson 90 min a’ cleachdadh 200 μl de 70% MeOH.Às deidh centrifugation, chaidh an supernatant a chruinneachadh.Chaidh na grìogagan an uairsin a nighe aon uair le 100 μl de 70% MeOH agus chaidh na supernatants a thoirt còmhla.Chaidh sampaill a thiormachadh ann an inneal-cruinneachaidh falamh Speedvac agus a stòradh aig -20 ° C gus an tèid an sgrùdadh.
Gus peptides atharraichte ocsaidean singlet a chomharrachadh agus a thomhas, chaidh sampallan ath-sgaoileadh ann an searbhag formic 0.1% agus chaidh 1 μg de pheptides a sgrùdadh le bhith a ’cleachdadh mòr-speactrometer Orbitrap Fusion Lumos Tribrid uidheamaichte le stòr nano ESI bho Tune agus Xcalibur bho bhathar-bog reiceadair 4.3.Chaidh sampaill a sgaradh air colbh capillary 75 µm × 15 cm air a phacaigeadh a-staigh le stuth 3 µm C18 (ReproSil-pur, # r13.b9.) agus ceangailte ri siostam EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).Chaidh na peptides a sgaradh le cromatagrafaidheachd caisead sreathach 95 mionaid bho 8% solvent B gu 50% solvent B (A = 0.1% searbhag foirmeil ann an uisge, B = 0.1% searbhag foirmeil ann an 80% acetonitrile), agus an uairsin àrdachadh gu sreathach gu 98% B min. ann an 6 min aig ìre sruth de 300 nl / min.Bidh Orbitrap Fusion Lumos a’ cruinneachadh dàta mu seach eadar làn scan MS agus scan MS2 a rèir an dàta.Chaidh an bholtadh sputtering a shuidheachadh gu 2.1 kV agus bha teòthachd an capillary còmhdhail ion aig 320 ° C.Chaidh speactra MS (350-2000 m / z) a chruinneachadh le rùn de 120,000, AGC 4 × 105, agus ùine cuir a-steach as àirde de 150 ms.Bha na 10 ro-ruitheadairean iomadaichte as cumanta anns gach làn scan air an sgaradh le bhith a’ cleachdadh HCD le lùth bualadh àbhaisteach de 30%, uinneag aonaranachd ceithir-cheàrnach de 1.6 m / z, agus suidheachadh fuasglaidh de 30,000.Targaid AGC airson mòr-speactrometry tandem a’ cleachdadh 5 × 104 agus an ùine cuir a-steach as àirde 150 ms.Tha an eisgeachd fiùghantach air a shuidheachadh gu 30 diogan. Chaidh ionsan neo-ainmichte no an fheadhainn le cosgais 1+ agus > 7+ a dhiùltadh airson MS/MS. Chaidh ionsan neo-ainmichte no an fheadhainn le cosgais 1+ agus > 7+ a dhiùltadh airson MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ agus >7+ были отклонены для МС/МС. Chaidh ionsan neo ionsan neo-ainmichte le cosgais 1+ agus >7+ a dhiùltadh airson MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Chaidh ionsan neo ianan neo-ainmichte le cosgaisean 1+ agus >7+ a dhiùltadh airson MS/MS.
Tha an dàta amh air a phròiseasadh a’ cleachdadh an àrd-ùrlar coimpiutaireachd FragPipe stèidhichte air MSFragger.Chaidh claonaidhean mòra agus amino-aigéid co-fhreagarrach a dhearbhadh le bhith a’ cleachdadh algorithm sgrùdaidh fosgailte le fulangas mòr ro-làimh de -150 gu 500 Da.Chaidh peptides atharraichte an uairsin a chomharrachadh le bhith a’ cleachdadh atharrachaidhean histidine le buannachdan mòra de +229.0964 agus +247.1069 Da ann am PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Chaidh ceallan a bha a’ cur an cèill an gine miniSOG aonaichte a chuir ann an soithichean 6 cm.Nuair a ràinig iad ~ 80% confluence, chaidh ceallan a nighe aon uair le HBSS (Gibco, #14025092), an uairsin air an giùlan le probes ceimigeach ann an HBSS airson 1 uair aig 37 ° C agus air an soillseachadh le solas gorm.10W LED airson 20 mionaid aig teòthachd an t-seòmair.Gus faighinn a-mach dè an seòrsa de ghnè ocsaidean reactive a tha an sàs ann am PDPL, vitimín C 0.5 mM (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), Chaidh mannitol 100 mM (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 a chur ris na ceallan mar stuthan cur-ris.Às deidh nighe le PBS fuar, chaidh ceallan a sgrìobadh, a chruinneachadh ann an tiùban centrifuge 1.5 ml, agus sonicated le tip airson 1 min ann an 200 μl de PBS le inhibitor protease 1x gun EDTA (1 s agus 1 s às aonais, amplitude 35%).Chaidh am measgachadh a thàinig às a sin a mheadhanachadh aig 15,871 × g airson 10 min aig 4 ° C agus chaidh an dùmhlachd supernatant atharrachadh gu 1 mg / mL a’ cleachdadh pasgan measaidh pròtain BCA.Chaidh timcheall air 50 µl den lysate gu h-àrd a bhrosnachadh le 0.1 mM rhodamine azide (Aladdin, àireamh. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, agus 1 mM CuSO4 airson 1 uair aig teòthachd an t-seòmair le cuairteachadh bho bhonn gu mullach.Às deidh an ath-bhualadh cliog, chaidh sileadh le acetone a dhèanamh le bhith a’ cur 250 μl de acetone ro-fhuaraichte ris na sampallan, a’ toirt a-steach -20 ° C airson 20 min agus centrifuging aig 6010 × g airson 10 min aig 4 ° C.Cruinnich am peileag agus goil ann an 50 µl de bhufair 1x Laemmli airson 10 mionaidean aig 95 ° C.Chaidh sampaill an uairsin a sgrùdadh air gels fada SDS-PAGE agus an sealladh a’ cleachdadh siostam ìomhaighean Bio-rad ChemiDoc MP Touch le bathar-bog Image Lab Touch.
Chaidh cur an cèill agus glanadh a’ phròtain ath-leasaichte miniSOG-6xHis a dhèanamh mar a chaidh a mhìneachadh roimhe.Ann an ùine ghoirid, chaidh ceallan E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) atharrachadh le pET21a-miniSOG-6xHis agus chaidh abairt pròtain a thoirt a-steach le 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Às deidh lysis cealla, chaidh pròtanan a ghlanadh le bhith a’ cleachdadh grìogagan agarose Ni-NTA (MCE, àireamh 70666), air an dialyzed an aghaidh PBS, agus air an stòradh aig -80 ° C.
Airson assay faisg air bileag in vitro stèidhichte air antibody, measgachadh 100 μM miniSOG air a ghlanadh, 1 mM probe 3, agus 1 μg antibody monoclonal luchag anti-label (TransGen, #HT501-01) ann am PBS gu meud freagairt iomlan de 50 μl..Chaidh am measgachadh ath-bhualadh a irradachadh le solas gorm LED airson 0, 2, 5, 10, agus 20 min aig teòthachd an t-seòmair.Chaidh am measgachadh a ghintinn le 0.1 mM biotin-PEG3-azide (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, agus 1 mM CuSO4 airson 1 h aig teòthachd an t-seòmair air inneal gluasad suas.Às deidh freagairt snap, cuir bufair 4x Laemmli gu dìreach ris a ’mheasgachadh agus goil aig 95 ° C airson 10 mionaidean.Chaidh sampaill a sgrùdadh air gels SDS-PAGE agus an sgrùdadh le blotting an iar le streptavidin-HRP (1: 1000, Solarbio, #SE068).
Chaidh peptide synthetigeach anns an robh histidine le amidation C-terminal (LHDALDAK-CONH2) a chleachdadh gus mion-sgrùdadh a dhèanamh air bileagan in vitro stèidhichte air peptide faisg air làimh.Anns a ’mheasadh seo, chaidh miniSOG puraichte 100 μM, probe 10 mM 3 agus 2 μg / ml peptide synthetigeach a mheasgachadh ann am PBS ann an tomhas freagairt iomlan de 50 μl.Chaidh am measgachadh ath-bhualadh a irradachadh le solas LED gorm airson 1 uair aig teòthachd an t-seòmair.Chaidh aon microliter de shampall a sgrùdadh le bhith a’ cleachdadh siostam LC-MS (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight spectrometer mòr le bathar-bog anailis speactram MassLynx).
Chaidh ceallan HEK293T a chuir an cèill gu seasmhach gine fusion miniSOG a shìolachadh ann an soithichean 10 cm airson loidhnichean le diofar sgìreachadh organelle (Mito, ER, Nucleus) agus soithichean 15 cm airson loidhnichean Parkin-miniSOG agus BRD4-miniSOG.Nuair a ràinig iad ~ 90% confluence, chaidh na ceallan a nighe aon uair le HBSS, an uairsin an toirt a-steach le probe 3 ann an HBSS airson 1 uair aig 37 ° C agus air an soillseachadh le LED gorm 10 W aig teòthachd an t-seòmair.Airson bileagan neo-conaltraidh de Parkin, chaidh giùlan 10 µM proton carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) le probe 3 ann an HBSS a chuir ris airson 1 uair aig 37 ° C.Bha na ceumannan lysis cealla, ceimigeachd cliog, lughdachadh agus alkylation an aon rud ris a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd, ach a-mhàin gun deach 2 mg de lysate a chur ris agus chaidh biotin PEG3 azide a chleachdadh anns an ath-bhualadh cliog an àite biotin azide a ghabhas atharrachadh.Às deidh beairteas, chaidh na grìogagan a nighe 3 tursan le 5 ml de PBS anns a bheil 0.2% SDS, 3 tursan le 5 ml de PBS anns a bheil 1 M urea, agus 3 tursan le 5 ml de PBS.Às deidh sin, chaidh 2 µg trypsin a chur ri 300 µl 25 mM ABC anns an robh 1 M urea gus am pròtain a ghlanadh thar oidhche aig 37 ° C.Chaidh stad a chuir air an ath-bhualadh le bhith a’ cur searbhag formic ris gus an ruigeadh pH de 2-3.Às deidh trypsinization air grìogagan, chaidh am fuasgladh peptide a mhilleadh le bhith a’ cleachdadh colbh SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) agus air a thiormachadh ann an inneal-cruinneachaidh falamh Speedvac.Chaidh peptides ath-sgaoileadh ann an searbhag formic 0.1% agus chaidh 500 ng de pheptides a sgrùdadh le bhith a’ cleachdadh mòr-speactrometer Orbitrap Fusion Lumos Tribrid uidheamaichte leis an stòr nano-ESI a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd.Chaidh peptides a sgaradh air ro-cholbhan malairteach RP-HPLC (75 μm x 2 cm) (Thermo, no. 164946) agus colbhan anailis RP-HPLC (75 μm x 25 cm) (Thermo, no. 164941), an dà chuid air an lìonadh le 2 μm.caisead bho 8% gu 35% ACN ann an 60 mionaid, an uairsin àrdachadh gu sreathach gu 98% B ann an 6 mionaidean aig ìre sruth de 300 Nl / min.Chaidh speactra MS (350-1500 m/z) a chruinneachadh le rùn de 60,000, AGC 4 × 105, agus ùine cuir a-steach as àirde de 50 ms.Bha ionsan taghte air an sgaradh le HCD ann an cearcallan 3 s le lùth bualadh àbhaisteach de 30%, uinneag aonaranachd ceithir-cheàrnach de 1.6 m / z, agus rùn de 15000. Targaid AGC mòr-speactrometer tandem 5 × 104 agus ùine stealladh as àirde. de 22 ms air a chleachdadh.Tha an às-dùnadh fiùghantach air a shuidheachadh gu 45 diogan. Chaidh ionsan neo-ainmichte no an fheadhainn le cosgais 1+ agus > 7+ a dhiùltadh airson MS/MS. Chaidh ionsan neo-ainmichte no an fheadhainn le cosgais 1+ agus > 7+ a dhiùltadh airson MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ agus >7+ были отклонены для МС/МС. Chaidh ionsan neo ionsan neo-ainmichte le cosgais 1+ agus >7+ a dhiùltadh airson MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Chaidh ionsan neo ianan neo-ainmichte le cosgaisean 1+ agus >7+ a dhiùltadh airson MS/MS.
Bha na ceumannan ullachaidh sampall suas gu beairteas grìogagan NeutrAvidin an aon rud ris an sgrùdadh LC-MS / MS a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd.Chaidh timcheall air 50 μg de lysate a chleachdadh mar chur-a-steach airson smachd luchdachadh agus chaidh 2 mg de lysate a chleachdadh airson ath-bheachdan cliog.Às deidh beairteas agus nighe le neutravidin, chaidh na pròtanan ceangailte a chuir às le bhith a’ cur 50 μl de bhufair Laemmli ris na grìogagan roisinn agarose agus a’ goil aig 95 ° C. airson 5 mionaidean.Chaidh mion-sgrùdadh a dhèanamh air cuir a-steach luchdan smachd agus sampallan beairteach le grìogagan le SDS-PAGE agus chaidh an gluasad gu membran PVDF (Millipore, #ISEQ00010) a rèir modhan àbhaisteach Western blot.Chaidh na buill-bodhaig a bhacadh le bainne sgith 5% (Sangon, #A600669) ann an TBS anns an robh 0.1% tween-20 (TBST) agus air an goir ann an sreath le antibodies bun-sgoile agus àrd-sgoile.Chaidh antibodies bun-sgoile a lagachadh 1:1000 ann am bainne sgith 5% ann an TBST agus an goir thar oidhche aig 4 ° C.Chaidh antibodies àrd-sgoile a chleachdadh ann an co-mheas de 1:5000 agus chaidh an goir airson 1 uair aig teòthachd an t-seòmair.Chaidh na buill-bodhaig fhaicinn le chemiluminescence a’ cleachdadh siostam ìomhaighean Chemidoc BP.Tha a h-uile sganadh neo-ghearraichte de bhlotaichean is gels san fhigear air a thaisbeanadh mar dàta amh.
Am measg antibodies bun-sgoile a chaidh a chleachdadh san sgrùdadh seo bha antibody monoclonal coineanach an-aghaidh SFPQ (CST, àireamh 71992), antibody monoclonal coineanach an-aghaidh FUS (CST, àireamh 67840), antibody polyclonal coineanach an-aghaidh NSUN2 (Proteintech, àireamh. 20854-1-). AP), antibody polyclonal coineanach an-aghaidh mSin3A (Abcam, #ab3479), antibody monoclonal anti-tag luchag (TransGen, #HT201-02), luchag antibody monoclonal anti-β-actin (TransGen, #HC201-01), coineanach antibody -CDK2 antibody monoclonal (ABclonal, #A0094), antibody monoclonal coineanach gu CTBP1 (ABclonal, #A11600), antibody polyclonal coineanach gu DUT (ABclonal, #A2901), antibody polyclonal coineanach gu PSMC4 (ABclonal, #A2505), coineanach anti- Antibody polyclonal DNAJB1 (ABclonal, # A5504).Chaidh na antibodies sin a chleachdadh aig lagachadh 1:1000 ann am bainne sgith 5% ann an TBST.Am measg nan antibodies àrd-sgoile a chaidh a chleachdadh san sgrùdadh seo bha IgG an-aghaidh coineanach (TransGen, #HS101-01), IgG an-aghaidh luchag (TransGen, #HS201-01) aig lagachadh 1:5000.
Gus tuilleadh sgrùdaidh a dhèanamh a bheil BRD4 ag eadar-obrachadh le SFPQ, chaidh ceallan seasmhach HEK293T agus BRD4-miniSOG a tha a ’toirt cus cuideam air HEK293T a chuir ann an soithichean 10 cm.Chaidh ceallan a nighe le PBS fuar agus an laighe ann am bufair lysis Pierce IP 1 ml (Thermo Fisher, #87787) le inneal-dìon protease gun EDTA airson 30 mionaidean aig 4 ° C.Às deidh sin, chaidh na lysates a chruinneachadh ann an tiùban centrifuge 1.5 ml agus centrifuge aig 15,871 xg airson 10 min aig 4 ° C.Chaidh an supernatant a bhuain agus a ghintinn le 5 µg de antibody monoclonal luchag le bileag anti-V5 (CST, #80076) thar oidhche aig 4 ° C.Nigh timcheall air 50 µl de ghrìogagan magnetach pròtain A / G (MCE, #HY-K0202) dà uair le PBS anns a bheil 0.5% Tween-20.An uairsin chaidh na lysates cealla a ghluasad le grìogagan magnetach airson 4 uairean aig 4 ° C le cuairteachadh bho bhonn gu mullach.An uairsin thèid na grìogagan a nighe ceithir tursan le 1 ml de bhufair PBST agus a ghoil aig 95 ° C airson 5 mionaidean.Chaidh sampaill a sgrùdadh air gels SDS-PAGE agus an gluasad gu membran PVDF a’ cleachdadh modhan àbhaisteach Western blot.Chaidh na buill-bodhaig a bhacadh ann am bainne sgith 5% ann an TBST agus chaidh an goir ann an sreath le antibodies bun-sgoile agus àrd-sgoile.Chaidh antibody monoclonal bun-sgoile Antibody Rabbit anti-SFPQ (CST, #71992) a chleachdadh aig co-mheas de 1: 1000 ann am bainne sgith 5% ann an TBST agus air a bhrosnachadh thar oidhche aig 4 ° C.Chaidh IgG an-aghaidh coineanach a chleachdadh aig co-mheas de 1:5000 agus chaidh a ghèilleadh airson 1 uair aig teòthachd an t-seòmair.Chaidh na buill-bodhaig fhaicinn le chemiluminescence a’ cleachdadh siostam ìomhaighean Chemidoc BP.
Chaidh a h-uile structar a chaidh a chleachdadh airson mion-sgrùdadh Sgìre uachdar so-ruigsinneach (SASA) fhaighinn bhon Bhanca Dàta Protein (PDB)52 no Stòr-dàta Structar Pròtain AlphaFold53.Chaidh SASA iomlan a thomhas airson gach fuigheall a’ cleachdadh prògram FreeSASA.Cha deach ach dàta SASA coileanta agus gun teagamh airson histidine le bileag agus a nàbaidhean a chleachdadh gus an SASA cuibheasach fhaighinn airson gach structar.Chaidh an ruigsinneachd fuasglaidh coimeasach (RSA) airson gach histidine a thomhas le bhith a’ roinneadh luach iomlan SASA leis an raon uachdar fuigheall empirigeach as àirde a tha ri fhaighinn don t-solusach.Bha a h-uile histidines an uairsin air an seòrsachadh mar fhalach ma bha an RSA cuibheasach nas ìsle na 20%, air dhòigh eile fosgailte56.
Chaidh faidhlichean amh a fhuaireadh ann am modh DDA a sgrùdadh le bhith a’ cleachdadh Proteome Discoverer (v2.5) no MSfragger (Fragpipe v15.0) anns an stòr-dàta pròtain iomchaidh dearbhte SwissProt anns an robh truaillearan cumanta.Bha feum aig na peptides air trypsin iomlan le dà làrach glanaidh a bha a dhìth, carbamoyl methylation mar atharrachadh stèidhichte agus oxidation methionine mar atharrachadh fiùghantach.Chaidh fulangas cuideam ro-ruithear agus criomag a shuidheachadh gu 10 ppm agus 0.02 Da (MS2 Orbitrap), fa leth. Chaidh buillean truaillidh a thoirt air falbh, agus chaidh pròtanan a shìoladh gus ìre lorg meallta de <1% fhaighinn. Chaidh buillean truaillidh a thoirt air falbh, agus chaidh pròtanan a shìoladh gus ìre lorg meallta de <1% fhaighinn. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить кожони кожони кожнони Chaidh buillean truaillidh a thoirt air falbh agus chaidh pròtanan a shìoladh gus ìre lorg meallta de <1% a thoirt seachad.去 除污染物命中,过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率). <1% 的错误发现率. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложения ложения уровня ложания Chaidh buillean truaillidh a thoirt air falbh agus chaidh pròtanan a shìoladh gus ìre dearbhach meallta de <1% fhaighinn.Airson mion-sgrùdadh cainneachdail gun a bhith a’ cleachdadh bhileagan, chaidh susbaint pròtain àbhaisteach bho thrì ath-aithrisean bith-eòlasach a chleachdadh.Chaidh mion-sgrùdadh sgìreachadh subcellular pròtain a dhèanamh a’ cleachdadh mion-sgrùdadh Gene Ontology (GO) bho DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 agus stòran-dàta air an cur ri chèile agus air am foillseachadh leis a’ bhuidheann Alice Ting.Chaidh am mapa bholcàno fhaighinn bho Perseus (v1.6.15.0). Chaidh atharrachaidhean fillte pailteas pròtain a dhearbhadh airson brìgh staitistigeil a’ cleachdadh deuchainn-t dà-thaobh, agus chaidh buillean pròtain a chomharrachadh le atharrachadh pailteas> 2 (mura h-eilear ag ràdh a chaochladh) agus luach p <0.05. Chaidh atharrachaidhean fillte pailteas pròtain a dhearbhadh airson brìgh staitistigeil a’ cleachdadh deuchainn-t dà-thaobh, agus chaidh buillean pròtain a chomharrachadh le atharrachadh pailteas> 2 (mura h-eilear ag ràdh a chaochladh) agus luach p <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Chaidh atharrachaidhean fillte susbaint pròtain a dhearbhadh airson brìgh staitistigeil a’ cleachdadh deuchainn-t dà-earball, agus chaidh maidsean pròtain a chomharrachadh le atharrachadh susbaint> 2 (mura h-eilear ag ràdh a chaochladh) agus luach ap <0.05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 倍数 变化 的 的 统计 统计 显着性 显着性 蛋白质 中 中 的 丰度 变化 变化 说明 说明 说明) 值 p 值 <0.05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 数 变化 的 的 统计 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 命 丰度 变化 变化 变化 说明 说明) 值 p 值 <0.05. Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Chaidh cudromachd staitistigeil atharrachaidhean fillte ann an susbaint pròtain a dhearbhadh le bhith a’ cleachdadh deuchainn-t dà-earball, agus chaidh maidsean pròtain a dhearbhadh airson atharrachaidhean susbaint> 2 (mura h-eilear ag ràdh a chaochladh) agus p-luachan <0.05.Chaidh mion-sgrùdadh eadar-obrachadh pròtain a dhèanamh a’ cleachdadh mion-sgrùdadh GO còmhla ris an stòr-dàta String.
Chaidh trì ath-aithrisean bith-eòlasach a dhèanamh le toraidhean co-chosmhail.Chaidh mion-sgrùdadh staitistigeil a dhèanamh le GraphPad Prism (bathar-bog GraphPad) agus chaidh plotaichean bholcàno a chruthachadh le Perseus (v1.6.15.0).Gus coimeas a dhèanamh eadar an dà bhuidheann, chaidh luachan-p a dhearbhadh le bhith a’ cleachdadh deuchainn-t Oileanach dà-earball.Cha robh ach pròtanan singilte a chaidh an comharrachadh co-dhiù dà uair sa bhuidheann deuchainneach air an toirt a-steach do na plotaichean bholcàno, agus chaidh Perseus a chuir an àite nan luachan co-fhreagarrach a bha a dhìth sa bhuidheann smachd bho chuairteachadh àbhaisteach gus an gabhadh an luach-p obrachadh a-mach.Tha bàraichean mearachd a’ riochdachadh a’ mheadhan ± claonadh àbhaisteach.Ann an sgrùdaidhean proteomic airson mion-sgrùdadh staitistigeil, chaidh am pailteas de phròtainean a nochd ann an co-dhiù dà mhac-samhail bith-eòlasach a ghleidheadh.Cha deach dòighean staitistigeil a chleachdadh gus meud an t-sampall a dhearbhadh ro-làimh.Chan eil na deuchainnean air thuaiream.Cha robh an luchd-rannsachaidh dall air na gnìomhan rè deuchainn agus luachadh nan toraidhean.
Airson tuilleadh fiosrachaidh mu dhealbhadh sgrùdaidh, faic geàrr-chunntas Aithisg Rannsachadh Nàdair ceangailte ris an artaigil seo.
Chaidh an dàta mòr spectrometry a fhuaireadh san sgrùdadh seo a chuir a-steach gu Co-bhanntachd ProteomeXchange tro stòr com-pàirtiche iProX57 fo sheata dàta ID PXD034811 (data PDPL-MS).Tha dàta amh air a thoirt seachad ann an cruth faidhlichean dàta amh.Tha an artaigil seo a’ toirt seachad an dàta tùsail.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. A’ faighinn eòlas air an nàbachd: a’ cleachdadh biotinylation a tha an urra ri faisg air làimh gus iom-fhilltean pròtain a chomharrachadh agus organelles a mhapadh. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. A’ faighinn eòlas air an nàbachd: a’ cleachdadh biotinylation a tha an urra ri faisg air làimh gus iom-fhilltean pròtain a chomharrachadh agus organelles a mhapadh.Gingras, AS, Abe, KT agus Raut, B. Eòlas air an àrainneachd: a’ cleachdadh biotinylation a tha an urra ri faisg air làimh gus iom-fhilltean pròtain a chomharrachadh agus organelles a mhapadh. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Tuigsinn na nàbachd: cleachd eisimeileachd na nàbachd air beatha bith-eòlasach.Gingras, AS, Abe, KT agus Raut, B. A 'tuigsinn cho faisg' sa tha: comharrachadh iom-fhilltean pròtain agus mapadh organelles a 'cleachdadh biotinylation a tha an urra ri faisg air làimh.Gnàthach.Mo bheachd.Ceimigeach.bith-eòlas 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.A’ mapadh a’ mhicro-àrainneachd le bhith a’ gluasad lùth Dexter gu ceallan dìon.Saidheans 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.Bidh lìonraidhean sgèile dà-proteome a’ lorg ath-dhealbhadh cealla-sònraichte air an eadar-obrachadh daonna.ceallan 184, 3022–3040.e3028 (2021).